caspase-12 siRNA探讨WEHI-3细胞内质网应激反应性凋亡机制的实验研究

摘要

一、益康唑诱导WEHI-3细胞凋亡的实验研究 『目的』研究益康唑(Econazole)诱导鼠粒单系白血病细胞WEHI-3凋亡的机制。凋亡相关蛋白在此过程中表达活化的变化。 『方法』应用Econazole诱导鼠急粒单系白血病WEHI-3细胞凋亡。AnnexinV/PI双染实验、Tunnel实验和琼脂糖凝胶电泳实验测定细胞凋亡。.Fura-2荧光负载技术检测细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)。RT-PCR和Westernblot检测内质网应激反应性凋亡相关基因的表达变化。分析白血病内质网应激反应性凋亡的机制。 『结果』Econazole作用于WEHI-3细胞后，WEHI-3细胞出现典型的凋亡改变。细胞内游离[Ca2+]i较对照组明显升高，RT-PCR和Westernblot检测结果显示Econazole处理WEHI-3细胞后，显示在此凋亡过程中，caspase-7，9，12出现不同程度的活化，caspase-3无明显变化，伴侣蛋白GRP78表达增加。 『结论』在Econazole可诱导WEHI-3细胞凋亡。细胞内钙动员，钙浓度显著增加。凋亡相关蛋白caspase-12表达活化明显。内质网应激诱导Caspase-12表达的同时也导致胞质中Caspase-7转移到内质网表面，Caspase-7激活caspase-12，导致细胞的凋亡caspase-12的表达在此过程中表达增加。 二、caspase-12siRNA在内质网的凋亡中研究 『目的』构建携带EGFP的短发夹环RNA(siRNA)真核表达载体。构建针对caspase-12的siRNA质粒(PsiRNA-caspase-12)，观察其在体外对鼠粒单系白血病细胞WEHI-3细胞对凋亡的抵抗作用。 『方法』应用聚合酶链反应(PCR)的方法从psiRNA-H1质粒上扩增出H1启动子及其下游BbsI酶切位点。将扩增的产物连入pEGFP-C1载体MluI位点处，构建成携带EGFP的siRNA真核表达载体。应用该载体介导针对EGFP的短发夹环RNA(pEGFP-H1/EGFP)，转染Hela细胞，通过荧光显微镜检测EGFP的表达，验证所构建载体在细胞内产生RNA干扰的效果。应用载体pEGFP-H1介导针对caspase-12的siRNA(psiRNA-caspase-12)转染WEHI-3细胞，实验分为对照组，pEGFP-H1转染组和pEGFP-H1/caspase-12转染组三组。通过荧光显微镜检测EGFP的表达，RT-PCR检测胞内caspase-12的mRNA的表达，Westernblot方法检测胞内caspase-12蛋白的表达。同时筛选转染pEGFP-H1和PsiRNA-caspase-12的WEHI-3稳定细胞株。并检测转染后WEHI-3细胞的抗凋亡能力。MTT检测EGFP-H1/caspase-12对WEHI-3细胞增殖的影响。 『结果』pEGFP-H1与pEGFP-Cl在Hela细胞中的转染效率分别为(80.37±4.23)％和(84.29±5.81)％(P＞0.05)。与对照组比较pEGFP-H1/EGFP在细胞内对EGFP的抑制效果达77.9％.与空载体转染组相比，psiRNA-caspase-12对caspase-12的抑制率达68％。空白对照组、pEGFP-H1组和pEGFP-H1/caspase-12组在15μmol/Econazole，作用24小时后的凋亡率为(72.3±3.12)％、(68.7±4.23)％和(36.5±2.26)％.在5×105U/LTNF-α作用24小时后的凋亡率分别为(53.8±2.68)％、(59.2±3.27)％和(57.3±1.56)％。空白对照组、pEGFP-H1组和pEGFP-H1/Caspase-12组各组之间差异无显著性。 『结论』成功构建携带EGFP的siRNA真核表达载体。pEGFP-H1介导针对caspase-12的短发夹环RNA(psiRNA-caspase-12)能有效抑制WEHI-3细胞中caspase-12的表达，并对内质网应激性凋亡具有抵抗能力。对非内质网应激性凋亡无抵抗能力。pEGFP-H1/caspase-12对WEHI-3细胞增殖的无影响。

目录

本文中的英文缩写词汇

第一部分益康唑诱导WEHI-3细胞凋亡的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分caspase-12siRNA在内质网的凋亡中研究

前言

材料与方法

材料

实验方法

实验方法一、携带EGFP和shRNA真核表达载体的构建

实验方法二、表达caspase-12siRNA的pEGPF-H1/caspase-12载体质料的构建和鉴定

实验方法三、统计学处理

结果

讨论

参考文献

综述:RNAi干扰作用的机制及其研究进展

附录

致谢