利用Uromodulin启动子及其3’端GPI锚定序列在肾小管上皮细胞中表达hEPO的研究：肾脏生物反应器

摘要

第一部分hEPO基因的克隆及其表达的研究
　　 目的克隆人促红细胞生成素（hEPO）基因序列，构建hEPO基因的真核表达载体pcDNA3.1hEPO 并在Hela细胞中表达hEPO。
　　 方法：采用逆转录及巢式PCR 方法从人肾组织中克隆hEPO cDNA，将PCR 产物亚克隆到pMD18 载体并测序。采用定点突变技术纠正PCR过程中产生的碱基突变位点。利用脂质体转染Hela细胞并用Western blot检测hEPO蛋白的表达情况。
　　 结果测序结果证实三个碱基突变位点得以纠正，得到序列完全正确的hEPO cDNA。脂质体成功转染Hela细胞后Western blotting 检测到hEPO蛋白的表达。
　　 结论成功构建了含hEPO基因的表达载体pcDNA3.1hEPO，并在真核细胞中成功表达。
　　 第二部分Uromodulin基因启动子表达特异性的研究
　　 目的比较Uromodulin基因启动子在多种不同真核细胞中表达的特异性及活性。
　　 方法：对含Uromodulin基因启动子的真核表达质粒pEGFP-URO进行测序鉴定，利用脂质体转染技术，将质粒转染人近端肾小管上皮细胞系（HK-2）、人肾癌细胞系（ACHN）、人膀胱癌细胞系（T24）、大鼠系膜细胞系（HBZY-1），用荧光显微镜和流式细胞仪观察绿色荧光蛋白（GFP）表达的情况。经激发光照射后发出绿色荧光的为阳性细胞，并和pEGFP-N3进行对照研究。
　　 结果转染24h后HK-2、ACHN阳性率较高（7-12/HP），流式检测结果为13.2％和11.4％；而T24、HBZY-1阳性率较低(0-1／HP)，流式检测结果为0％和0．8％。pEGFP-N3在各组细胞中均有较高表达，其阳性率分别为23.08％(HK-2)、19.24％(ACHN)、26.14％(T24)和18.03％(HBZY-1)。
　　 结论小鼠Uromodulin基因启动子在HK-2及ACHN中具有特异性的启动活性，其活性约为CMV的一半。
　　 第三部分Uromodulin基因3’端GPI 锚定序列的克隆及其在肾小管上皮细胞中膜定位功能的研究
　　 目的克隆Uromod ulin基因N’端SP 序列和C’端GPI 锚定序列，利用EGFP在肾小管上皮细胞中验证其膜定位功能。
　　 方法：采用逆转录PCR 方法从小鼠肾组织中克隆Uromod ulin cDNA 全长序列，利用巢式PCR 克隆出Uromod ulin基因的N’端SP 序列和C’端GPI 锚定序列。与报告基因EGFP构建真核表达质粒pN3 SP-EGFP-GPI，转染上皮细胞系HK-2后在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达及膜定位情况。
　　 结果成功获得Uromod ulin基因C’端的GPI 锚定序列，经测序与预计序列一致。pN3 SPEGFP-GPI 转染HK-2细胞后在荧光显微镜下观察到绿色荧光，其中大部分定位于细胞膜。 结论利用Uromod ulin基因的SP/GPI 序列能够将外源表达蛋白定位于上皮细胞膜。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分hEPO基因的克隆及其表达的研究

第二部分Uromodulin基因启动子表达特异性的研究

第三部分Uromodulin基因3’端GPI锚定序列的克隆及其在肾小管上皮细胞中膜定位功能的研究

综述基因工程制药的转基因技术及表达系统

致谢

附录1在校期间已发表和待发表的文章