牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白多克隆抗体制备及间接ELISA方法的建立与应用

摘要

牛病毒性腹泻/粘膜病（Bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD）由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起，可引起牛群临床和病理学症状，表现为繁殖障碍、胎儿畸形及广泛的免疫抑制，导致牛群生产力低下和严重的粘膜病，从而造成世界范围养牛业的重大损失。牛病毒性腹泻病毒基因组编码11种蛋白，其中E2蛋白是病毒主要的保护性抗原，能诱导中和抗体的产生，保护实验动物不受同源毒株的攻击。利用已有的表达BVDVE2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化表达菌BL21（DE3），经培养诱导表达出重组E2蛋白，Westernblot显示纯化的重组E2蛋白能够与BVDV阳性血清反应。用纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备了多克隆抗体，病毒中和试验测定其中和抗体效价为1:2048。间接免疫荧光和免疫印迹试验证实了其具有良好的反应性。间接免疫荧光试验证明其在1:1280倍稀释时仍具有较高的活性。本研究所制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于国内BVDV的检测，同时为进一步建立检测BVDVE2蛋白的ELISA奠定了基础。
　　 将纯化后的BVDVE2蛋白作为包被抗原建立了检测牛病毒性腹泻病毒抗体的间接ELISA，将其命名为E2-ELISA。通过一系列试验，确定了重组抗原最佳包被浓度（12.8μg/ml）；最佳封闭液（1％明胶）和最佳封闭时间（60min）；血清样本最佳稀释度（1:160）和最佳作用时间（60min）；酶标二抗最佳工作浓度（1:5000）和最佳作用时间（60min）；底物最佳显色时间（10min）；判定临界值（OD>10.364者判为阳性，OD<0.364者判为阴性）。交叉反应试验表明，该重组抗原与其它常见6种牛病的阳性血清不发生交叉反应。阻断试验表明，BVDV细胞培养液能在很大程度上阻断重组抗原与阳性血清的反应，而对阴性血清没有明显的影响。重复性试验表明，批内重复的变异系数小于10％，批间重复的变异系数小于10％。与病毒中和试验相比，符合率、特异性和敏感性分别为86.3％、82.6％和87.7％。与瑞典进口全病毒ELISA诊断试剂盒相比，符合率、特异性和敏感性分别为87.5％、85％和88.3％。应用BVDVE2-ELISA检测了黑龙江省内的852份牛血清样本，其抗体阳性率为74.18％（632/852）。上述结果表明，BVDVE2-ELISA诊断方法具有较好的敏感性和特异性，显示出了良好的应用前景。
　　 本研究成功表达了BVDVE2基因，获得了以包涵体形式表达的重组E2蛋白，制备了具有高病毒中和活性和特异性的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体。同时利用纯化的重组蛋白成功建立了快速简便的BVDVE2-ELISA。这些研究为BVDV的检疫及控制提供了有力的技术支持。

目录

文摘

英文文摘

Contents

1 引言

1.1 牛病毒性腹泻概述

1.1.1 病原体

1.1.2 病原生物型

1.2 持续性感染及流行病学

1.2.1 持续性感染

1.2.2 流行病学

1.3 诊断方法研究进展

1.3.1 血清学诊断方法

1.3.2 分子生物学技术

1.4 牛病毒性腹泻的防治及根除措施

1.5 研究目的及意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.1.1 细胞、病毒株、菌株、重组质粒及实验动物

2.1.2 血清及抗体

2.1.3 主要试剂

2.1.4 主要仪器

2.2 试验方法

2.2.1 重组E2蛋白的制备及纯化

2.2.2 重组E2蛋白多克隆抗体的制备

2.2.3 重组E2蛋白多克隆抗体的鉴定

2.2.4 间接ELISA操作程序

2.2.5 牛病毒性腹泻E2-ELISA诊断方法相关条件的优化

2.2.6 牛病毒性腹泻E2-ELISA阴阳性判断标准的确定

2.2.7 特异性试验

2.2.8 重复性试验

2.2.9 比较试验

2.2.10 牛病毒性腹泻间接E2-ELISA的初步应用

3 结果与分析

3.1 重组E2蛋白原核表达载体鉴定及表达产物的SDS-PAGE与Western blot分析

3.2 重组E2蛋白多克隆抗体的鉴定

3.2.1 兔源重组E2蛋白多克隆抗体病毒中和效价的检测

3.2.2 兔源重组E2蛋白多克隆抗体的免疫荧光检测

3.2.3 兔源E2蛋白多克隆抗体的免疫印迹检测

3.3 牛病毒性腹泻E2-ELISA相关条件优化的结果

3.3.1 抗原最佳包被浓度与血清最佳稀释度的确定结果

3.3.2 封闭液的确定

3.3.3 封闭液时间的确定

3.3.4 血清最佳作用时间的确定结果

3.3.5 二抗最佳工作浓度与最佳作用时间的确定结果

3.3.6 底物最佳显色时间的确定结果

3.4 牛病毒性腹泻E2-ELISA阴阳性判定标准确定结果

3.5 特异性试验结果

3.5.1 阻断试验结果

3.5.2 交叉试验结果

3.6 重复性试验结果

3.6.1 批内重复性试验结果

3.6.2 批间重复性试验结果

3.7 比较试验

3.7.1 与中和试验检测结果的比较

3.7.2 与瑞典全病毒ELISA检测试剂盒检测结果的比较

3.8 应用建立的诊断方法检测国内部分地区样品的结果

4 讨论

4.1 牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的表达及纯化

4.2 BVDV E2蛋白兔源多克隆抗体的制备

4.3 蛋白兔源多克隆抗体的鉴定及应用

4.4 BVDV E2间接ELISA反应条件的优化

4.5 BVDV E2间接ELISA诊断方法判定标准的确定

4.6 BVDV E2间接ELISA诊断方法的初步应用及前景

5 结论

致谢

参考文献

附录

攻读硕士学位期间发表的论文