大鼠精原干细胞分离纯化方法的探讨

摘要

随着社会经济发展,人类生活方式的改变,男性不育的发病率逐年升高。由于男性不育的发病机制和某些环节还不甚了解,男性不育的治疗面临着治疗手段单一,治疗效果欠佳的局面。目前,睾丸生精功能下降所致无精子症尚无确切疗效的治疗方法。精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)是精子形成的前体细胞,具有永生化和多能化潜能,在睾丸微循环中具有增殖分化能力。现有资料证实SSCs移植于具有免疫豁免的异体睾丸内仍可继续分化。SSCs移植技术可以使睾丸性无精子症患者产生精子并获得生育能力,通过夫妇间常见的方式自然受孕,符合伦理学及传统观念,更易于患者接受。SSCs移植在治疗男性不育过程中可适用于青春期前和青春期进行放化疗的肿瘤患者。青春期或青春期前的男孩及青壮年男性的常见恶性肿瘤,例如:何杰金病、睾丸癌、白血病等,随着现代诊断技术和外科手术、放疗及化疗等诊疗水平的日益提高,这些患者的长期生存甚至治愈成为可能。而这类患者在治疗的过程中其睾丸生精功能受到严重损害。考虑到这一点,可在治疗前收集患者的SSCs并通过冷冻等方法保存起来,保存其生育能力。SSCs移植也适用于成年后才发现的双侧隐睾,其睾丸未下降到阴囊内的患者。这类患者睾丸在高温的持续作用下生精功能严重受损,临床表现为严重的少弱精子症,甚至无精子症。
　　有研究表明,这类患者的睾丸中仍有对热不敏感的SSCs和支持细胞,可利用SSCs培养及移植技术恢复睾丸生精功能。SSCs移植同时适用于严重的睾丸生精功能障碍患者等。近来,研究发现应用自体干细胞(脂肪源性干细胞、皮肤源性干细胞等)可分化诱导为生殖干细胞后进行移植,通过夫妇间正常的方式受孕。
　　本研究目的:1.探讨分离纯化精原干细胞(SSCs)的方法。2.探索简便实用的SSCs细胞培养方法,降低SSCs的培养成本。该研究作为自体成体干细胞(脂肪干细胞、皮肤干细胞等)移植入睾丸治疗少、无精子症系统研究的前期探索,将为后续研究提供宝贵经验,最终达到治愈睾丸性不育的目的。
　　材料与方法:1.实验动物选取出生后10天的健康SD雄性大鼠,体重19~25g,随机分三组:第一组:①机械法+两步酶法制备SSCs悬液;第二组:②机械法+两步酶法+percoll分离法制备SSCs悬液;第三组:③机械法+两步酶法+percoll分离法+差速贴壁法制备SSCs悬液。2.实验方法:2.1、取出生后10天的SD大鼠,脱颈处死后无菌收集双侧睾丸,分别通过①机械法+两步酶法制备SSCs悬液;②机械法+两步酶法+percoll分离法制备SSCs悬液;③机械法+两步酶法+percoll分离法+差速贴壁法制备SSCs悬液。2.2、c-kit的表达检测将获得的单细胞悬液处理后加入兔抗鼠c-kit多克隆抗体,再加入山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗,以PBS代替一抗作为对照,荧光显微镜下观察c-kit的表达情况。2.3、α6-Integrin的表达检测将纯化后的细胞悬液处理后加入兔抗鼠α6-Integrin多克隆抗体,再滴加即用型生物素化山羊抗兔IgG二抗,漂洗后滴加SABC试剂,再次漂洗。滴加DAB显色液,以三蒸水终止染色反应,再分别经乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜下观察α6-Integrin的表达情况,用以PBS代替一抗作为对照。2.4、台盼蓝排斥试验检测将获得的单细胞悬液,用血球记数板分别计数活细胞和死细胞,计算细胞活性率。2.5、精原细胞纯度的流式细胞仪检测将获得的单细胞悬液固定,漂洗,再离心收集细胞。加入兔抗鼠c-Kit多克隆抗体,4℃过夜。PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG-FITC荧光二抗,4℃避光孵育。PBS漂洗两次,再以PBS重悬细胞后进行流式细胞仪检测。同时设立以PBS代替一抗的阴性对照,在进行流式细胞仪检测时将相应的阴性对照消减为零,消除自发荧光背景。2.6、将获得的单细胞悬液进行培养观察,免疫组化鉴定,台盼蓝排斥试验及流式细胞仪检测后对结果进行比较分析。
　　结果：1、①机械法+两步酶法制备SSCs悬液;②机械法+两步酶法+percoll分离法制备SSCs悬液;③机械法+两步酶法+percoll分离法+差速贴壁法制备SSCs悬液生长情况符合SSCs。2、以c-kit受体作为SSCs的特异性标记物,行细胞免疫组化染色,结果细胞膜和核周胞质强表达c-kit。以α6-Integrin受体作为SSCs的特异性标记物,行细胞免疫组化染色,结果细胞膜和胞质表达α6-Integrin。两者与之对应的对照均呈阴性。3、以台盼蓝排斥试验检测细胞活率:①机械法+两步酶法细胞活率(93.26±1.06)％,②机械法+两步酶法+percoll分离法3带细胞活率(93.50±0.85)％,③机械法+两步酶法+percoll分离法+差速贴壁法3带细胞活率(94.73±0.82)％;三种方法活率比较:三种方法所得SSCs活率无统计学差异(P>0.05)。4、①机械法+两步酶法制备SSCs悬液精原细胞阳性细胞百分率为(63.34±0.79)％。②机械法+两步酶法+percoll分离法制备SSCs悬液精原细胞阳性细胞百分率为(74.98±0.26)％。③机械法+两步酶法+percoll分离法+差速贴壁法分离纯化SSCs精原细胞阳性细胞百分率为(79.17±0.83)％。三种方法纯度比较:三种方法间纯度不同(P<0.05)。多重两两比较结果:三种方法两两之间纯度不同(P<0.05):②法精原细胞阳性细胞百分率高于①法;③法精原细胞阳性细胞百分率高于②法;①,②,③法所得SSCs纯度呈增高趋势(P<0.05)。
　　结论:1.机械法,两步酶法,差速贴壁法,percoll分离法在分离纯化过程中对SSCs活率影响一致。2.机械法+两步酶法能够分离出较高纯度的SSCs,结合percoll分离法能够使SSCs纯度提高。3.差速贴壁法在应用机械法,两步酶法,percoll分离法的同时能够进一步富集SSCs。

目录

中文摘要

English Abstract

论文部分 大鼠精原干细胞分离纯化方法的探讨

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图

参考文献

综述部分 精原干细胞在男性不育中的应用

参考文献

附录部分

中英文对照缩略词表

致谢