农杆菌介导棉花遗传转化及转phyA植株的获得

摘要

本研究以优良的陆地棉品种冀无2031、中521和农大94.7为受体材料，利用农杆菌介导的方法，将含有根特异性表达启动子的phyA基因转入供试品种的下胚轴中，利用正交设计方法优化了农杆菌侵染棉花下胚轴的转化条件，并获得抗性愈伤组织;将phyA基因导入珂312和珂201的胚性愈伤组织中.获得了经PCR检测的转基因植株；以珂312、中521和农大94-7的茎尖分生组织为受体，获得了含phyA基因的T2代植株，进一步对转基因植株的后代进行根系植酸酶活性分析，为棉花现代分子育种增添新的内容和新的种质材料，同时为农作物有效利用土壤有机磷资源开辟一条经济有效的途径。主要研究结果如下: 1.通过正交设计方法，研究了农杆菌介导的棉花下胚轴遗传转化过程中菌液浓度、侵染时间、共培养时间和共培养温度对抗性愈伤转化效率的影响。结果表明，四个因素均对抗性愈伤的诱导率有极显著影响，其诱导效应依次是共培养温度>菌液OD值>侵染时间>共培养时间。按照正交设计的原则，最终得到农杆菌介导转化棉花下胚轴的最佳条件是:菌液OD值为0.3，侵染15min，24℃共培养24h。研究了卡那霉素(Km)对棉花愈伤组织诱导和生长的影响，结果表明，不同的品种对Km的敏感性不同，中521愈伤组织的筛选压为150mg/L，冀无2031和农大94-7愈伤组织的筛选压为100mg/L。 2.利用优化的条件，以珂312、中521和农大94-7的茎尖分生组织为受体，获得了含phyA基因后代植株，Southern杂交证实外源基因已整合到棉花基因组中。通过对具有Southern斑点杂交信号的6棵T1代和9棵T2代单株进行植酸酶根系活性分析表明T1代和T2代单株根系分泌活性都明显高于未转化的对照单株，是对照的1.32～7.76倍。 3.利用优化的条件，将phyA基因导入珂312和珂201的胚性愈伤组织中，获得了经PCR检测的转基因桓株。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：本文所用英文缩略词及中文对照

声明

1引言

2材料和方法

2.1材料和仪器试剂

2.1.1植物材料

2.1.2生化试剂

2.1.3质粒、菌株和载体

2.1.4 PCR引物

2.1.5主要仪器

2.1.6培养基类型与配制

2.2试验方法

2.2.1以下胚轴为受体的农杆菌介导转化体系

2.2.2以茎尖为受体的农杆菌遗传转化

2.2.3以胚性愈伤组织为受体的遗传转化

3结果与分析

3.1以下胚轴为受体的农杆菌介导转化体系建立

3.1.1农杆菌中的质粒检测

3.1.2 Km对愈伤组织出愈率的影响

3.1.3 Km对愈伤组织增殖的影响

3.1.4农杆菌介导转化过程中不同转化参数对转化的影响

3.1.5抗性愈伤组织DNA的分子检测结果

3.2以茎尖为受体的农杆菌介导的遗传转化

3.2.1外源激素对茎尖生长的影响

3.2.2不同固化剂对茎尖生长的影响

3.2.3不同处理茎尖方法对茎尖生长的影响

3.2.4基因型对转化效率的影响

3.2.5 Km对茎尖分生组织生长的影响

3.2.6 Km筛选过程中茎尖的生长状态

3.2.7影响再生苗嫁接成活率的因素

3.2.8 T0代Km抗性植株的分子检测

3.2.9 T1代植株的分子检测、遗传分析和根系分泌植酸酶的活性分析

3.2.10 T2代植株的分子检测、遗传分析和根系分泌植酸酶的活性分析

3.3以胚性愈伤为受体的遗传转化

3.3.1抑菌培养和选择培养的效果

3.3.2 Km抗性植株的PCR检测

4讨论

4.1正交设计在农杆菌介导转化中的应用

4.2受体材料的选择

4.3植酸酶的应用

4.4转基因植株遗传的稳定性

5结论

参考文献

在读期间发表的学术论文

作者简历

致谢

版图说明

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附表 磷标准曲线