抗枯萎病香蕉种质的挖掘及其抗病相关基因的克隆与表达分析

摘要

香蕉枯萎病是世界香蕉生产的毁灭性病害，要消除香蕉枯萎病等病害对香蕉产业的威胁，根本出路在于培育抗病的品种。鉴于栽培香蕉主要是不结实的三倍体或多培体及其传统育种的艰难，香蕉抗病育种的突破寄希望于生物技术育种。而挖掘各种香蕉的抗病基因资源，克隆抗病基因是进行香蕉遗传改良的重要基础。 本研究首先利用基于rDNA内转录间隔区(ITS)的PCR-RFLP标记和RAPD技术对采自深圳的三种野生蕉遗传多样性进行了分析，并采用三个已报道与香蕉枯萎病相关的RAPD标记及苗期接种鉴定对其枯萎病的抗性进行了研究。研究结果表明野生蕉1号和3号为AA基因型：野生蕉2号为BB基因型。在遗传相似性系数为0.32处，可将同属．AA基因型的野生蕉1号和3号，与贡蕉(AA)和巴西蕉(AAA)聚为一类；基因型为BB的野生蕉2号，与基因型为ABB的粉蕉和大蕉聚为一类。与香蕉枯萎病相关的RAPD标记分析以及香蕉枯萎病早期诊断实验结果均表明野生蕉2号和3号感香蕉枯萎病，而野生蕉1号抗病。 采用同源序列克隆法分离野生蕉1号抗病基因类似序列。根据核苷酸结合位点(nucleotide binding site，NBS)和丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域(serine/threonine kinase domain)设计简并性引物，以野生蕉1号(Musa acuminata cv.Shenzhen 1(AA))叶片cDNA为模板进行PCR扩增。经过对扩增产物进行克隆和测序，获得了6个500bp左右的RGAs片段。其中有两个RGAs(WNB1和WNB2)具有NB-ARC保守结构域特征，并且WNB1具有连续的ORF。其余4个RGAs(WST1，WST2，WST3和WST4)均具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域特征，且LWST3编码的氨基酸序列与水稻抗叶斑病基因Xa21同源性很高。用半定量PCR分析枯萎病菌诱导后野生蕉叶片中RGAs的表达情况，结果表明WNB1和WST3受枯萎病菌诱导后表达量增强，这表明WNB1和WST3的表达可能与香蕉枯萎病抗性相关。 木质素作为细胞阻止病原入侵的第一道保护屏障，在植物防卫反应中起着重要作用，而苯丙氨酸解氨酶作为木质素合成途径的第一个关键酶，其作用非常重要。为了研究苯丙氨酸解氨酶基因在大蕉与枯萎病菌互作中的作用，利用RT-PCR和RACE技术克隆了大蕉苯丙氨酸解氨酶基因全长cDNA。此cDNA长1300 bp，包含一个长为1191 bp，编码397个氨基酸的完整开放阅读框(ORF)，推导的氨基酸序列与水稻PAL基因氨基酸序列同源性达89％，将此基因命名为M-PAL． Southern杂交结果表明大蕉中存在一个包含4-5个PAL基因的基因家族，将此基因克隆到大肠杆菌表达载体pET32(a+)中，表达的蛋白质分子量大小与推导的相一致，并且表达的蛋白质表现出PAL酶活性。对接种香蕉枯萎病菌4号生理小种FOC race 4后大蕉叶片中M-PAL基因的转录谱进行研究表明，在接种枯萎病菌后M-PAL基因在叶片中的转录水平提高，因此推测M-PAL基因的表达可能与香蕉枯萎病抗性相关。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词表

第一章前言

1.1香蕉枯萎病

1.1.1香蕉枯萎病的发病特征

1.1.2香蕉枯萎病的分布和危害

1.1.3枯萎病病原菌生理小种的分类

1.1.4枯萎病病原菌的致病机制

1.1.5香蕉抗枯萎病的抗性机制

1.1.6影响香蕉抗病性的因素

1.1.7抗病性鉴定方法

1.1.8香蕉枯萎病的防治

1.1.9香蕉抗枯萎病育种研究进展

1.2植物抗病基因克隆研究进展及对香蕉基因克隆的启示

1.2.1植物抗病基因的结构特点

1.2.2植物抗病基因的结构特点对香蕉基因克隆的启示

1.3植物抗病防卫基因及其表达调控的研究

1.3.1植物防卫基因主要类型及特征

1.3.2植物防卫基因的表达调控研究

1.4本项目的研究意义

第二章抗枯萎病野生蕉资源的挖掘及其抗病基因同源序列(RGAs)的克隆与表达分析

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1材料

2.2.2方法

2.3结果与讨论

2.3.1供试三类野生蕉的基因型分析

2.3.2 8种供试香蕉RAPD扩增产物的多态性分析

2.3.3三种野生蕉与栽培品种的遗传距离及聚类分析

2.3.4三类野生蕉的枯萎病抗性分析

2.3.5利用简并引物克隆抗病相关序列及其特征分析

2.3.6野生蕉RGAs的系统进化分析

2.3.7野生蕉RGAs在枯萎病菌诱导后的表达分析

2.3.8受诱导表达的RGAs全长序列分析

2.4讨论

2.4.1抗枯萎病4号生理小种的野生蕉资源挖掘

2.4.2抗枯萎病野生蕉中抗病基因同源序列的分离与表达分析

第三章大蕉组培苗的枯萎病抗性鉴定及其木质素合成相关基因的克隆和表达分析

3.1引言

3.2材料和方法

3.2.1材料

3.2.2苗期枯萎病鉴定

3.2.3植物RNA提取、cDNA合成、RACE以及序列分析

3.2.4半定量RT-PCR表达分析

3.2.5植物DNA提取、酶切、电泳及转膜

3.2.6质粒载体中探针DNA的PCR扩增和探针标记

3.2.7 Southern杂交

3.2.8大肠杆菌质粒的提取

3.2.9质粒DNA酶切

3.2.10 DNA与质粒连接

3.2.11 大肠杆菌表达载体构建

3.2.12表达载体转化入溶源性大肠杆菌BL21(DE3)及鉴定

3.2.13溶源菌BL21(DE3)中检测表达产物

3.2.14细菌细胞粗酶液的制备及其酶活性测定

3.2.15植物超表达载体构建

3.2.16农杆菌感受态细胞的制备与转化

3.2.17农杆菌转化子的PCR鉴定

3.2.18农杆菌介导M-PAL基因转化贡蕉和龙芽蕉悬浮细胞

3.3结果与分析

3.3.1大蕉体细胞变异植株抗/感枯萎病的鉴定

3.3.2大蕉木质素合成相关基因的克隆及表达分析

3.4讨论

3.4.1大蕉组培苗体细胞变异植株的抗性分析

3.4.2木质素合成相关基因的分离及表达分析

参考文献

附录

致谢