环孢素对正常人和类风湿性关节炎病人记忆性Th17细胞的抑制作用及其机制

摘要

类风湿性关节炎(RA)是一种慢性全身免疫性疾病，以炎症细胞浸润关节滑膜、滑膜增生和软骨组织破坏为特征。临床表现为受累关节疼痛、肿胀和功能下降。全世界约有1％的人口患有类风湿性关节炎。而在我国，RA病人约有400万人。RA的病因目前尚不清楚，有学者提出辅助性T细胞亚群(Th)及其细胞因子在RA的发病机制中有非常重要的作用。以往的研究认为，RA是Th1细胞介导的自身免疫性疾病，主要由IFN-γ、TNF-α和IL-6等细胞因子参与疾病的发生与发展。但近年来，人们发现一群新的CD4+T细胞亚群——Th17细胞在其发病过程中扮演着及其重要的角色。Th17细胞主要分泌IL-17。IL-17是促炎因子，可促进单核细胞产生IL-1和TNF-α，还可在局部关节刺激滑膜细胞分泌炎症相关因子IL-6、IL-8、GM-CSF和PGE2。研究发现，RA病人的关节滑液中含有较高水平的IL-17和富集大量的Th17细胞。另外，在RA的动物模型中，阻断IL-17分泌后，炎症反应明显降低，骨组织破坏也显著改善。这都提示IL-17和Th17细胞可能是将来治疗RA的重要靶点。 环孢素A(cyclosporin A，CsA)是一种传统的免疫抑制剂。由Borel于1972年首次发现，是从真菌培养液中分离获得的中性环状十一肽化合物。CsA最初应用于器官移植，如今被广泛应用于治疗各种自身免疫性疾病，如类风湿性关节炎(RA)、银屑病、IgA肾病、糖尿病等。目前，CsA对细胞免疫作用机制还不是十分明确。虽然有研究报道其可通过影响T细胞内钙依赖的信号途径，从而抑制细胞因子的合成与分泌，但仍需进一步的探索。近年，有人发现小剂量的CsA可抑制佛波酯和离子霉素刺激RA病人关节滑液中IL-17的分泌；也有人发现，CsA可抑制IL-15刺激正常人和RA病人单个核细胞(PBMCs)产生IL-17。因此，本课题从细胞免疫角度，研究CsA对正常志愿者和RA病人PBMCs和CD4+T细胞亚群分泌IL-17的影响，并进一步揭示CsA的作用机制，为临床应用CsA治疗RA提供了更充分的理论依据。 1、目的 以体外淋巴细胞培养为模型，研究临床常用免疫抑制药物环孢素A对Th17淋巴细胞产生IL-17的抑制作用，并探讨其作用机制，为临床上应用环孢素A进一步提供理论依据。 2、方法 2.1抽取正常人(32人)和RA病人(6人)外周静脉血。用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。 2.2分离正常人的PBMCs，加入抗CD4免疫微磁珠抗体孵育，将LS柱放置于磁珠分离器上磁性分离结合抗CD4微磁珠抗体的CD4+T细胞。取2×105纯化的细胞，加入CD4-PE抗体孵育，应用流式细胞术检测CD4+T细胞的纯化率，CD4+T细胞阳性率超过95％，用于细胞培养。 2.3用抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激分离的PBMCs和CD4+T细胞，利用半定量RT-PCR观察细胞因子IL-17 mRNA的表达，利用ELISA检测培养上清中IL-17和IFN-γ产生的量，利用流式细胞术观察产生IL-17和IFN-γ阳性细胞的表型和表达情况。同时，利用流式细胞术观察代表细胞活化的细胞表面标志物CD69和CD25及代表细胞增殖的BrdU掺入和CFSE标记的变化。 3、结果 3.1在抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激条件下，环孢素A呈剂量依赖性抑制正常人PBMCs和CD4+T细胞产生IL-17，并抑制IL-17 mRNA的转录。环孢素A的作用强度与时间呈正相关。 3.2在抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激条件下，环孢素A可降低正常人记忆性IL-17+T细胞的阳性率，抑制BrdU的掺入和减少CFSE标记的细胞分裂次数；环孢素A可抑制T细胞活化分子CD69、CD25的平均荧光密度。 3.3RA病人PBMCs经抗CD3抗体和抗CD28抗体刺激后，IL-17的产生明显高于正常人PBMCs(P<0.05)。环孢素A可抑制RA病人IL-17的产生和IL-17+T细胞的表达。 结论： CsA抑制正常人和RA病人CD4+T淋巴细胞IL-17 mRNA的转录和IL-17细胞因子的产生，其部分机制是抑制T淋巴细胞的活化和增殖。

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