血中不同转移潜能肝癌细胞生物学特性及其基因差异表达

摘要

肝细胞癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一,全球每年的新发病例50～100万之多,其中42％在中国。肿瘤切除或肝移植是治疗该病的首选手段,但术后复发转移较高,影响其治疗效果。大肝癌行根治性切除术后5年复发率80％以上,即使小肝癌(≤5cm)也达到40％～50％理论上肝移植是有希望彻底治疗该病的最佳选择,因为它既切除了病灶,又减少了肝硬化的发生,但是移植的效果令人失望,据文献报道,一年内50～70％的移植病例在移植肝或远处复发。疗效不佳的主要原因就在于肝癌具有血行性转移早的特点。研究表明:部分肝癌病人在肝癌切除或肝移植前,已有肿瘤细胞脱落进入血液循环系统中,他们是导致肝癌转移和复发的关键。 目前，国内外对实体瘤患者外周血中循环肿瘤细胞的研究,多局限于利用细胞学或分子生物学的方法对外周血或骨髓中循环肿瘤细胞进行检测。但进入血液循环系统中的循环肿瘤细胞的生物学特性,以及其导致复发转移的具体机制尚不明确。本项目拟以肝癌为研究对象,通过免疫磁株细胞分离技术富集分离肝细胞癌患者外周血中循环肿瘤细胞,通过临床随访观察其来源患者是否出现肝外转移,明确其不同转移潜能,研究其生物学特性,并对其差异表达基因进行分析对比,研究其生物学本质及引起血源性复发转移的发生机制,为阻断原发性肝癌的血液转移提供理论依据和方法。 目的：建立免疫磁株富集、分离和纯化肝细胞癌患者外周血中的循环肿瘤细胞的方法,以及不同转移潜能的肝癌细胞筛选培养方法；明确血液中不同转移潜能的肝癌细胞的生物学特性；采用基因芯片技术,分析不同转移潜能的肝癌细胞的基因表达谱差异,期望发现与肝癌转移密切相关的基因和肝癌转移的特异信息通路,探索肝癌转移的分子机制,为寻找新的灵敏的预测转移的指标、设计干预治疗的新靶点,阻断原发性肝癌的血液转移提供理论依据,为最终克服肝癌转移提供有效的方法。 方法：随即选择临床收治的首次发病的肝癌患者为研究对象。采用免疫磁珠的方法,富集、分离肝癌患者术前、术后外周血中的肝癌细胞并进行培养。通过随访观察患者术后复发转移情况,综合分析术后患者复发转移与术前、术后外周血癌细胞阳性和阴性以及数量的关系。通过体内、体外实验筛选出不同转移潜能的癌细胞。采用基因芯片技术比较不同转移潜能的癌细胞的基因表达谱差异,筛选与肝癌转移有关的癌基因。 1.富集、分离肝癌患者循环血液中的循环肿瘤细胞。采集30例诊断明确的肝细胞癌患者未经过任何治疗前和在手术结束送病房前的外周静脉血,采用密度梯度离心的方法,分离单个核细胞。采用免疫磁珠的方法,分离富集细胞悬液中的癌细胞。常规病理和免疫组化鉴定分离富集的细胞类型。同时对所有被研究的患者的随访登记,定期复查,了解术后肿瘤复发和转移情况。 2.不同转移潜能的细胞株筛选鉴定根据外周血癌细胞检测情况和患者术后复发转移关系,随即选取4例不同情况的患者的外周血癌细胞：术前外周血癌细胞阳性,术后出现肝转移(标记为PT);术前外周血癌细胞阳性,术后未出现肝转移(标记为PNT);仅术后外周血癌细胞阳性,术后出现肝转移(标记为PPT);仅术后外周血癌细胞阳性,术后未出现肝转移(标记为PPNT)进行培养,检测其各自的生物学特性：绘制细胞生长曲线、检测细胞生长周期、核型分析及超微结构。比较它们的体外侵袭、运动能力和集落形成率；和裸鼠皮下和体内原位移植后,肿瘤在裸鼠体内的生长和转移情况,筛选出不同转移潜能的癌细胞。 3.基因芯片检测不同转移潜能的肝癌细胞基因表达使用含有4096条基因,其中包含OTS(原癌基因和抑癌基因)、ARP-SRP(细胞凋亡和应激反应蛋白相关基因)、IC(免疫相关基因)、ICTP(离子通道和运输蛋白相关基因),CCCP(细胞周期蛋白相关基因),FMS(细胞骨架和运动蛋白相关基因)、SRRP(DNA合成、修复和重复蛋白相关基因)、CR(细胞受体相关)、ECSCP(细胞信号和传递蛋白相关基因)、GC(发育相关基因)等的人肝癌表达谱芯片,检测从体内外实验研究的证明具有较强转移能力的细胞和转移潜能较弱的细胞的基因表达谱差异,并采用RT-PCR验证,筛选与肝癌转移有关的癌基因。 结果：1.免疫磁珠技术可以富集分离到肝癌患者外周血中游离癌细胞,具有较高的敏感性和特异性。30例不同分期的肝癌患者术前外周血肝癌细胞阳性16例(53.33％),术后阳性25例(83.33％),术前和术后阳性率比较,差异有统计学意义(P<0.05)。不同肿瘤分期,其术前、术后外周血癌细胞阳性率不同。健康对照外周血未检测到癌细胞。富集的癌细胞传代培养后,具有肝细胞癌的形态学特点,经AFP免疫组化染色阳性,证实为肝细胞癌细胞。2.随访28个月,30例肝癌患者中共有7例患者术后出现肝外转移,移率为23.33％；其中,术前外周血癌细胞阳性,术后出现肝外转移发生率为37.5％(6/16)：术后外周血癌细胞阳性的患者肝转移发生率为28.0％(7/25);术前外周血癌细胞阴性,术后外周血癌细胞阳性的患者,仅1例发生肝外转移；术后外周血癌细胞阴性的患者,其肝转移发生率为0％(0/26)。出现肝外转移的患者术前、术后外周血癌细胞浓度均大于1×103个/L,低于1×103个/L者未发现肝转移。3.富集的外周血中癌细胞生物学特性：(1) PT、PPT细胞体积大于PNT、PPNT细胞,PNT、PPNT细胞细胞核内通常有2-3个大核仁,但PT、PPT细胞核内的核仁数目则多为3-7个,核仁较小。电镜观察PNT、ppNT的突起短密。PT、PFT的溶酶体多倾向于集中于细胞的一极,而PNT、PPNT的溶酶体多倾向于弥散性分布。PT、PPT地生长速度明显快于PNT、PPNT。P-T、PPT DNA合成期和分裂期细胞的比例高于PNT、PPNT细胞。(2) PT、PPT组细胞穿过人工基底膜的细胞数高于PNT与PPNT组细胞,差异有统计学意义；PT与PPT、PNT与PPNT之间差异无统计学意义；PT、PPT运动能力明显强于PNT、PPNT的运动能力；但PT、PPT组与PNT、PPNT组的集落形成率的差异无统计学意义。4.动物实验:(1) 皮下接种移植后,PNT、PPNT组均未形成皮下瘤。PT组皮下成瘤率为100％(6/6),PPT组为66.7％(4/6)。PT与PPT皮下肿瘤成瘤时间、生长速度无差异。但生长方式有不同,PT组肿瘤明显呈浸润性,皮下肿瘤与深部组织融合生长,有2只浸及脊柱。(2) 皮下肿瘤肝脏原位移植:PNT、PPNT组均未形成皮下瘤,不再进行原位移植。PT组原位接种后10只裸鼠,肝脏成瘤率为100％,3只裸鼠有中等量血性腹水,5只见腹壁浸润,有2只膈肌转移,2只有肝胃、肝脾韧带浸润；全体裸鼠无胸水,肺及胸壁未见肉眼可见的转移灶,镜检见全部裸鼠有肺转移。PPT组未见有腹水,肝脏成瘤率为40％,肿瘤体积小于PT组；无腹壁浸润和腹腔内种植；全体裸鼠无胸水,肺及胸壁未见肉眼可见的转移灶,3只裸鼠双肺镜检见转移灶分布于周边肺。镜检PT组与PPT组肺部转移灶数目差异无统计学意义。 结论:1.免疫磁珠技术可以富集分离到肝癌患者外周血中游离癌细胞,具有较高的敏感性和特异性。2.不同肿瘤分期,其术前、术后外周血癌细胞阳性率不同,手术挤压可能导致外周血癌细胞增加；随着肿瘤分期的增高,外周血中癌细胞阳性率增高。健康对照外周血未检测到阳性细胞。3.患者肝外转移发生率与术前外周血癌细胞阳性明显相关。4.肝癌患者出现肝外转移,需要一定的癌细胞浓度,低于1×103个/L者未发现肝转移。5.外周血中细胞体积较小、核仁较小、核仁数目多；生长速度快,倍增时间短；DNA合成期和分裂期细胞的比例高的癌细胞具有较强的转移潜能。6.术前即进入外周血中的肝癌细胞具有较强的转移潜能,由于手术挤压或者其它原因导致肝癌细胞入血,其转移潜能较术前入血的癌细胞低。7.转移潜能大的癌细胞与转移潜能小的癌细胞在相关基因表达方面有明显差异,这些差异涉及到细胞周期、信号传导、基因组自身稳定机制、免疫相关等基因。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照缩略词表

第一部分外周血循环肿瘤细胞的分离富集

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分不同转移潜能的肝癌细胞的筛选与鉴定

材料和方法

结果

1细胞形态学观察及生物学特性观察

2体外侵袭及运动实验

3体内实验

讨论

结论

第三部分 基因芯片检测不同转移潜能的肝癌细胞基因谱的表达

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

附件

致谢