蓝氏贾第鞭毛虫包囊分化及逆境胁迫下sncRNA的研究

摘要

DNA、RNA和蛋白质是组成生命的三大类基本物质。其中DNA是遗传信息的携带者，蛋白质是生物功能的行使者，而对于RNA，传统的观点认为它们仅仅在DNA到蛋白质的遗传信息传递中充当“桥梁”。近年来的研究表明，RNA的种类及其在生命活动中所发挥的作用远比人们想象的要复杂。无论在原核生物还是在真核生物中，细胞内除了编码蛋白质的mRNA外，还存在数量众多、种类各异的非编码RNA（non-coding RNA，ncRNA），其中一部分ncRNA的长度介于20～500 nt，因此这类分子又被称为小分子非编码RNA（small non-coding RNA，sncRNA）。SncRNA可以作为结构分子或调控分子与蛋白质协同参与细胞内复杂的生命活动。蓝氏贾第鞭毛虫（Giardia lamblia，以下简称贾第虫）是一种介于原核生物和真核生物之间的单细胞病原微生物，国际上大多数学者认为它是迄今为止最原始的真核生物之一，有“活化石”之称，因此贾第虫是研究sncRNA的种类、结构与功能以及基因进化的一种良好的模式生物。贾第虫的整个生活史中有两种细胞形态：营养性的滋养体和具有感染性的包囊。滋养体在逆境胁迫下向包囊的分化代表了生物对逆境的最原始的适应。揭示参与这一过程的sncRNA的种类和生物学功能将补充真核生物基因调控网络，并且有助于更进一步地去理解生物对逆境的适应与进化，同时也将为贾第虫病的预防、诊断和治疗提供新的思路和切入点。 本研究在鉴定贾第虫包囊分化特异表达的sncRNA的过程中，揭示出一类长度约为46 nt的小分子RNA。它们稳定存在于包囊分化24 hr后的贾第虫细胞中，并且有着较高的丰度，在溴化乙锭染色的凝胶中可以被直接观察到。序列分析结果表明，这些分子不是细胞内RNA的随机降解片断，大部分序列来自于成熟tRNA的3’部分，且切割位点几乎都位于tRNA三叶草型二级结构的反密码左臂，因此被命名为sitRNA（stress—induced tRNA—derived RNAs）。tRNA切割为sitRNA的现象普遍存在于贾第虫的整个tRNA家族，而不是某些tRNA所特有切割的现象。与文献报道的tRNA半分子有所不同，sitRNA在包囊分化初期（3 hr）便开始迅速积累，且随着培养时间的延长，它们并不是趋于降解，而是在整个包囊分化过程中稳定表达，在24 hr丰度最高。这一现象揭示sitRNA在贾第虫包囊分化的起始及维持过程中发挥着重要的作用。包囊分化是贾第虫对外界恶劣条件所做出的一种适应性生存反应，那么其它逆境胁迫是否也能诱导sitRNA产生？本研究检测了低温、高温及血清剥夺培养等胁迫条件下的滋养体细胞，发现tRNA成熟体均可被诱导切割为sitRNA分子。尤其在血清剥夺后，sitRNA在很短的时间内即可出现，并且随着饥饿时间的延长，成熟tRNA及sitRNA逐渐被降解，而此时大量的tRNA半分子在细胞中积累。尽管低温、高温及血清剥夺不能诱导贾第虫滋养体向包囊分化，但它们与包囊分化过程的一个共同特点是机体的整体代谢水平明显下调。与tRNA半分子不同，sitRNA在贾第虫应激过程中稳定存在，并且当压力撤除后，sitRNA又可以消失。据此可以推测，tRNA在应激过程中被切割成sitRNA分子与细胞基因表达整体水平下调有关，从而使贾第虫在胁迫条件下维持相对较低的代谢水平。因此，本研究认为，sitRNA的产生是贾第虫包囊分化及对逆境所作出的一种普遍反应。其它生物的tRNA是否能够被诱导切割为sitRNA分子以应对突发的生理和外界环境的变化？这是一个值得深入探讨的课题。目前，除了贾第虫外，在其它生物中尚未发现sitRNA分子。因此，贾第虫可作为研究生物应对不利环境和适应性机制的良好模式。进一步研究贾第虫sitRNA分子的加工过程及生物学功能将有助于阐明原生动物维持生活周期以及对逆境做出快速和恰当反应的机制。 在贾第虫滋养体向包囊分化的过程中是否还存在其它不能经溴化乙锭染色检测的低丰度的sncRNA?因此本研究采用了Solexa高通量测序技术，以期系统地研究滋养体和包囊分化24 hr的细胞中sncRNA的种类、丰度及表达上的差异。序列分析结果表明，在滋养体和包囊中存在大量～26 nt的GilM/GilT反转座子及mRNA来源的内源性siRNA。其中GilM/GilT反转座子相关的rasiRNA可能通过介导反转座子的基因沉默和端粒的异染色质形成，从而维持基因组的稳定性；mRNA来源的siRNA可能在转录后水平调控相关mRNA的基因沉默。此外，本研究在滋养体和包囊文库中鉴定出5个以snoRNA为前体的miRNA（miR5～miR9）。虽然丰度很低，但这暗示着miRNA介导的翻译抑制也许是一种调控基因表达的古老的方式。由于贾第虫基因组在结构和组成上都很紧凑，因此snoRNA除了行使rRNA修饰功能外，也可以作为miRNA的前体参与基因表达调控，这为研究miRNA的起源与进化提供了很好的依据。进一步比较滋养体和包囊文库中小RNA的组成可以发现，在包囊文库中，来自结构ncRNA（如rRNA、tRNA、snRNA及snoRNA）的小分子数目增多，这也许是因为在包囊分化这一特殊的生理状态下，细胞内转录和翻译水平下降，因此结构ncRNA不再参与这些过程，成为功能上“冗余”的RNA分子，因而发生降解。相反，内源性siRNA和miRNA分子数目减少，一方面可能因为在包囊分化过程中这些小RNA分子调控基因表达的力度下降，另一方面也许是由于产生这些RNA的前体分子下调造成的。Solexa高通量测序的结果打开了认识贾第虫小分子RNA宝库的一扇大门，揭示出一个丰富多样而又复杂的小RNA世界。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1小分子非编码RNA的研究概况

1.1.1小分子非编码RNA的分类

1.1.2小分子非编码RNA的鉴定方法

1.2转运核糖核酸(tRNA)

1.2.1 tRNA的研究概况

1.2.2 tRNA的结构、生物合成及生物学功能

1.2.3 tRNA在基因表达过程中的调控作用

1.2.4 tRNA与人类疾病的关系

1.3小干扰RNA

1.3.1 RNAi的研究历史

1.3.2 siRNA的生物发生和作用机制

1.3.3内源性siRNA的发现及生物功能

1.4贾第虫—一种良好的真核模式生物

1.4.1贾第虫介绍

1.4.2贾第虫小分子非编码RNA的研究现状

1.5本研究的目的和意义

第二章材料与方法

2.1贾第虫的培养

2.1.1菌株与培养基

2.1.2贾第虫细胞的培养

2.2贾第虫细胞核的分离纯化

2.3贾第虫总RNA的提取、检测及DNase／RNase处理

2.3.1贾第虫总RNA的提取

2.3.2贾第虫总RNA的甲醛变性胶电泳检测

2.3.3总RNA的DNase／RNase处理

2.3.4总RNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离

2.4贾第虫cDNA文库的构建及筛选

2.4.1菌株与培养基

2.4.2割胶纯化～46 nt小分子RNA

2.4.3小RNA的BAP处理

2.4.4 3’Adaptor的连接

2.4.5 MAGNOTEX-SA的吸附

2.4.6 5’末端磷酸化

2.4.7 5’Adaptor的连接

2.4.8反转录反应

2.4.9 PCR

2.4.10 PAGE割胶回收PCR产物

2.4.11 PCR产物与载体的连接

2.4.12.Ecoli感受态细胞的制备(CaCl2法)

2.4.13转化

2.4.14菌落PCR筛选插入外源片段的阳性克隆

2.4.15重组质粒的提取及序列测定

2.5一类新的小分子RNA的鉴定及功能分析

2.5.1生物信息学分析

2.5.2 Northern杂交鉴定新的小分子RNA

2.5.3半定量RT-PCR

第三章结果与分析

3.1贾第虫包囊分化过程中一类～46 nt RNA的积累

3.1.1贾第虫滋养体的培养及包囊诱导

3.1.2细胞总RNA制备结果

3.1.3包囊分化过程中一类～46 nt RNA的积累

3.2 sitRNA的鉴定及表达分析

3.2.1特异性cDNA文库的构建路线

3.2.2 cDNA文库的筛选及序列分析结果

3.2.3 sitRNA的表达分析

3.2.4 tRNA假基因的切割情况

3.3其它逆境胁迫对sitRNA的影响

3.3.1血清剥夺诱导sitRNA的表达

3.3.2极端温度诱导滋养体中sitRNA的表达

3.4 sitRNA的亚细胞定位

3.4.1细胞核分离纯化

3.4.2 PAGE电泳及Northern杂交检测sitRNA的亚细胞定位

3.5半定量RT-PCR分析RNA内切酶

3.6滋养体和包囊分化24小时的小RNA Solexa测序及分析

3.6.1 Solexa高通量测序总体路线

3.6.2 Solexa测序结果概况

3.6.3两类内源性siRNA

3.6.4以snoRNA为前体的miRNA

3.6.5来自其它sncRNA的小RNA分析

第四章讨论

4.1贾第虫：研究sncRNA的良好的真核模式生物

4.2首次揭示贾第虫tRNA受逆境诱导被内切为sitRNA分子

4.3 tRNA调控途径的多样性

4.4贾第虫中数量庞大的小分子RNA

结 语

参考文献

附录

在学期间发表的学术论文

致 谢