ICOS共刺激通路参与角膜移植免疫排斥反应的实验研究

摘要

研究背景： 目前研究认为角膜移植免疫排斥反应主要是T细胞介导的迟发型超敏反应，是多种免疫细胞和分子共同参与、相互调节的复杂过程。T细胞活化需要两个信号的参与，即MHC-抗原肽信号和共刺激信号。如缺乏共刺激分子提供的共刺激信号，T细胞便不能活化而处于无能状态。在T细胞活化的不同阶段，多种共刺激分子发挥着重要的调节作用。其中可诱导共刺激分子(InducibleCostimulator,ICOS)是最近发现的一种参与T细胞活化的重要共刺激分子。 初步研究发现：ICOS是CD28家族成员之一，以ICOS介导的共刺激通路在多种器官移植免疫排斥中发挥重要作用，通过对该通路的干预可有效调节免疫排斥反应，并可从中探索防治免疫排斥反应的策略和手段。 同种异体角膜移植是目前治疗角膜盲最为有效的方法，但移植术后排斥反应仍是导致手术失败的主要原因。不断提高角膜移植的成功率是临床亟待解决的问题。因此加强对角膜移植免疫排斥反应机理的研究，以及从多种途径积极探索良好的抗排斥反应手段具有非常重要的理论与现实意义。 第一部分：ICOS共刺激通路参与角膜移植免疫排斥反应的研究 目的：通过建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，研究ICOS共刺激通路与角膜移植急性免疫排斥反应的关系。 方法：取健康清洁级Wistar大鼠及SD大鼠，分为移植组和正常对照组。移植组以10只Wistar大鼠为供体，20只SD大鼠为受体，建立同种异体穿透性角膜移植模型；对照组为5只健康清洁级正常SD大鼠(10眼)。移植术后每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片情况，并对角膜混浊、水肿、新生血管3项指标进行评分。分别于术后7天、14天取植片进行病理学观察，并采用RT-PCR法检测植片组织ICOSmRNA的表达情况，免疫组织化学法检测植片组织ICOS蛋白水平；同时采用流式细胞术检测外周血CD3+ICOS+T/CD3+T的表达情况，并以正常大鼠作对照。 结论： (1)大鼠同种异体穿透性角膜移植术后7天植片尚未发生排斥反应，术后第9天开始有大鼠植片发生排斥反应，至14天时移植鼠植片皆发生程度不同的急性排斥反应。 (2)正常大鼠角膜组织无ICOS蛋白表达，且未检出ICOSmRNA表达，与正常大鼠角膜组织各层均无淋巴细胞浸润的特征相符。 (3)移植术后植片组织可检测到ICOS蛋白及mRNA的表达，且术后14天的表达高于术后7天。该结果提示共刺激分子ICOS参与了角膜移植急性免疫排斥反应的发生。 (4)与正常大鼠外周血CD3+ICOS+T/CD3+T的表达相比，移植术后7天、14天外周血CD3+ICOS+T/CD3+T的表达皆升高，且14天时升高尤为明显，该结果再次提示共刺激分子ICOS与角膜移植急性免疫排斥反应关系密切。 第二部分：重组腺病毒Ad-EGFP转染大鼠角膜的实验研究 目的：评价携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP经不同转染途径原位转染大鼠角膜的可行性和安全性，探索重组腺病毒载体原位转染大鼠角膜的最佳途径。 方法：取健康清洁级SD大鼠80只，随机分为A、B、C、D4组，每组20只鼠。A组：近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射Ad-EGFP(滴度为2.3×1011v.p./ml)15μl；B组：近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射0.9％NaCl注射液15μl；C组：前房注射Ad-EGFP(滴度为2.3×1011v.p./ml)15μl；D组：前房注射0.9％NaCl注射液15μl。术后，每日于裂隙灯显微镜下观察角膜以及眼前段组织的变化。各组大鼠分别于注射后1天、3天、5天、7天及14天取材，每个时间点随机取4只大鼠，麻醉后处死，部分摘除术眼，石蜡包埋，切片行HE染色；部分取角膜，冰冻切片行共聚焦显微镜观察；部分角膜制备电镜标本，进行透射电镜观察角膜超微结构以及有无腺病毒颗粒存在。 结论： (1)携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP可通过不同途径原位转染至大鼠角膜组织。 (2)球结膜下注射途径可使腺病毒携带的报告基因在角膜上皮层及角膜基质层表达；前房注射途径可使腺病毒携带的报告基因在角膜内皮层表达。通过第一部分实验可知移植术后ICOS蛋白主要表达于植片上皮层及基质层，因此以ICOS为目的基因进行干预时球结膜下注射途径优于前房注射途径。 (3)携带报告基因的重组腺病毒Ad-EGFP安全性好，在原位转染角膜组织的同时未引起明显炎症及病理学改变。 第三部分：重组腺病毒载体RNA干扰阻断ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的研究 目的：观察携带有报告基因GFP且表达：ICOS-siRNA的重组腺病毒载体Ad-siICOS-EGFP阻断ICOS共刺激通路对角膜移植急性免疫排斥的抑制作用，探索利用RNA干扰技术阻断ICOS共刺激通路用于防治角膜移植免疫排斥反应的可行性。 方法：取健康清洁级Wistar大鼠(供体)及SD(受体)大鼠，建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型，并且随机分为4组，每组20只鼠：单纯角膜移植对照组(A组)；Ad-siICOS-EGFP注射组(B组)，术后即刻于近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射Ad-siICOS-EGFP(滴度为3.7×1011v.p./ml)15μl；Ad-EGFP注射组(C组)，术后即刻于近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射Ad-EGFP(滴度为2.3×1011v.p./ml)15μl；生理盐水注射组(D组)，术后即刻于近角膜缘12点位、6点位处球结膜下分别注射0.9％NaCl注射液15μl。术后每日在裂隙灯显微镜下观察角膜植片以及眼前段组织的变化。对角膜混浊、水肿、新生血管3项指标进行评分，观察排斥反应指数RI的变化并记录植片的存活时间。各移植组分别于术后5天随机取10只大鼠，麻醉处死后，部分角膜行免疫组织化学及RT-PCR检测；部分角膜冰冻切片行共聚焦显微镜观察。各组其余大鼠进行角膜植片存活时间统计。 结论： (1)Ad-siICOS-EGFP可以有效抑制大鼠植片组织ICOSmRNA及ICOS蛋白的表达，从而阻断ICOS共刺激通路。 (2)移植术后即刻受体鼠球结膜下注射Ad-siICOS-EGFP，可以抑制大鼠角膜移植急性免疫排斥反应，延长角膜植片存活时间。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文对照缩略词表

声明

前言

第一部分ICOS共刺激通路参与角膜移植免疫排斥反应的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 参考文献

附图

第二部分 重组腺病毒Ad-EGFP转染大鼠角膜的实验研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 参考文献

附图

第三部分重组腺病毒载体RNA干扰阻断ICOS共刺激通路抑制大鼠角膜移植免疫排斥反应的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

5 小结

6 参考文献

附图

全文结论

攻读博士学位期间科研成果

文献综述ICOS/ICOSL与移植免疫

综述 RNA干扰

致谢

统计学合格证明