新鲜分离的脂肪血管基质片段细胞促进兔脂肪移植存活的实验研究

摘要

临床上因先天性畸形、外伤及肿瘤切除术等各种原因所造成的软组织缺损的修复是整形修复外科面临的重大难题之一。自体游离脂肪移植，自Neuber于1893年首先报道用以填充切除瘢痕后的缺损以来，已有100多年的历史。相对于其他软组织充填法而言，脂肪移植具有许多潜在的优点：来源丰富，易于获取，无免疫原性，并且有良好的物理特性。 然而，脂肪移植物的低存活率及其体积存留的不可预知性，限制了其临床应用。移植物的存活期差异极大，且大块移植物的体积随着时间延长会显著减小。组织学检测显示移植的脂肪细胞进行性减少，移植物逐渐被纤维组织替代，且通常伴有囊泡形成。研究表明，初期移植物只能靠周围组织液的浸润和渗透来维持营养供应，而宿主的新生血管长入移植物一般要在移植后5天并且只能侵入移植物的周边部位，移植物中央部分的组织因缺血而坏死。因此临床常缩小脂肪移植物的体积，以利于周围营养物质的弥散及利用，直至新生血管形成。 显然，移植物早期建立及时而充分的血供，是提高其存活率的关键。近年来人们发现干细胞可促进新生血管形成以及抑制炎症反应，展示了干细胞在脂肪移植应用中的美好前景。但应用胚胎干细胞，会带来伦理学的困扰，且细胞的生物学特性，如致肿瘤性及自发畸胎瘤形成等限制了其在非致命性疾病的治疗。骨髓间充质干细胞作为可再生的成体干细胞，具有成骨、成软骨等多向分化能力，然而可收集的细胞数量少，需体外扩增，取材伴随的并发症等也不利于临床推广。 脂肪来源干细胞（ASCs）可自切取的以及抽吸的脂肪中均能分离获取。研究表明，形态类似成纤维细胞的ASCs，与骨髓干细胞一样，在体外具有向脂肪、骨、软骨、神经、心肌、平滑肌及骨骼肌等多个谱系分化的能力。值得一提的是ASCs可分化为血管内皮细胞，且在缺氧环境下可分泌促进血管形成的细胞因子，从而促进脂肪移植后的血管化进程。 本课题组前期的研究发现，体外培养的人ASCs混合脂肪颗粒移植于裸鼠皮下，促进新生血管形成，显著提高脂肪移植物的存活率。然而，体外培养获取自体ASCs显然无法完全满足临床需要。体外扩增最少需要2-3周的时间，这就意味者接受脂肪移植的患者需要二期手术。不仅如此，体外培养操作繁琐，易污染，安全性低。 因此，如何安全、方便的获取足够数量的、具有生物学效应的ASCs，是其应用于脂肪移植临床的关键。若能建立“脂肪干细胞库”，可随时获取同种异体来源的ASCs，移植则可一期完成，操作相对方便而快捷。近来一系列研究表明，ASCs在体内及体外均具有低免疫原性及免疫抑制效应，也提供了其同种异体移植应用的理论依据。 然而，应用同种异体来源的细胞，也存在交叉感染、安全性低的问题，因此，临床医师更倾向于应用自体细胞。我们选择从脂肪组织中新鲜分离的自体血管基质片段细胞（SVFs）辅助脂肪移植，既可避免交叉感染，安全性高，又能一期即时完成手术，易于临床推广。考虑到脂肪组织分布广泛，抽脂术可获取大量的脂肪，理论上，从这大量脂肪组织中新鲜分离，无需培养即可获取足够数量的、具有生物学活性的自体ASCs。 本实验分别以新鲜分离的自体SVF细胞以及体外培养的同种异体ASCs辅助脂肪移植，以培养的自体ASCs以及完全培养基作为对照，通过比较各组移植物湿重测量及HE染色切片分析，评价自体SVFs与同种异体ASCs对脂肪移植物存活率的影响，为临床选择一种更加安全、方便而有效的ASCs辅助干细胞疗法提供参考。 [材料与方法] 1、成年兔ASCs的体外分离和培养 切取成年兔腹股沟皮下脂肪垫，使用酶消化法获得SVF细胞，进行原代细胞培养及传代培养，观察细胞形态及功能变化。细胞传至第4代后，分成两等份，分别用于自体及同种异体移植。 2、ASCs的Di-I体外标记 为示踪脂肪干细胞，将新鲜分离的SVF细胞及培养的第4代ASCs在体外以Di-I标记，荧光显微镜观察细胞显色情况及形态变化。 3、兔细胞辅助脂肪移植（CAL）模型的建立 将Di-I标记后的，体外培养第4代自体ASCs（A组）、自体新鲜分离的ASCs（B组）、体外培养第4代的同种异体ASCs（C组）以及完全培养基（D组）与自体脂肪颗粒混合，按随机化原则注射于家兔腰背筋膜区皮下的四个受区（n=14）。 4、ASCs的Di-I体内示踪 1例移植术后1个月取材，切片检测Di-I红色荧光，结合苏木素染色切片显示组织形态，以揭示ASCs在体内的分化转归。 5、脂肪移植物存活的评价 13例移植术后6个月取材。测量移植物湿重，切片HE染色，以Gunderson“点计数”法定量评价移植物纤维坏死及脂肪细胞存活情况，以及新生血管密度。 6、统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）表示；四组脂肪移植物平均湿重的比较，血管密度、存活脂肪组织点数及纤维坏死组织点数的比较均采用随机区组设计资料的方差分析，各组均数的多重比较采用LSD法，P<0.05认为差异有统计学意义。 [结果] 1.术后6个月，自体ASCs组（A组）移植物湿重为（0.2693±0.0673）g，自体SVFs组（B组）湿重为（0.291±0.0721）g，同种异体ASCs组（C组）湿重为（0.2579±0.0715）g，均显著高于对照组（D组），（0.1778±0.06）g，P<0.05.A，B，C三组湿重均数之间两两比较，差异无显著性，P>0.05。提示自体SVFs及同种异体ASCs，与自体ASCs一样，均可提高脂肪移植物的长期存活率。 2.A组血管截面计数为（12.7±3.1）个/HPF，B组为（13.2±3.7）个/HPF，C组为（11.2±2.5）个/HPF，均显著高于对照组D组，（6.9±2.8）个/HPF，P<0.05.A，B，C三组血管截面计数均数之间两两比较，差异无显著性，P>0.05。说明自体SVFs及同种异体ASCs，与自体ASCs一样，均可促进脂肪移植物新生血管的形成。 3.A组切片存活的脂肪细胞计数为（6503±851）个/10HPF，B组为（6820±1021）个/10HPF，C组为（6658±858）个/10HPF，均显著高于对照组D组，（905±383）/10HPF，P<0.05.A，B，C三组存活脂肪细胞计数均数之间两两比较，差异无显著性，P>0.05。结果显示与自体ASCs一样，经自体SVFs及同种异体ASCs干预后脂肪移植物中脂肪细胞的存活数量均较培养基对照组明显增加。 4.A组切片纤维坏死细胞计数为（6336±848）个/10HPF，B组为（6135±918）个/10HPF，C组为（6181±829）个/10HPF，均显著低于对照组D组，（11694±625）个/10HPF，P<0.05.A，B，C三组纤维坏死组织计数点均数之间两两比较，差异无显著性，P>0.05。结果显示与自体ASCs一样，经自体SVFs及同种异体ASCs干预后均可减少脂肪移植物中纤维组织的形成及脂肪细胞的坏死数量。 5.荧光显微镜下，A，B，C三组均发现血管内皮细胞部分激发红色荧光。完全培养基对照组未发现此现象。结果提示自体SVFs及同种异体ASCs，与自体ASCs一样在体内可向血管内皮细胞分化，从而参与脂肪移植物的血管化进程。 [结论] 1.新鲜分离的自体SVFs与培养的自体ASCs一样，均可提高脂肪移植的存活率，但前者操作更方便快捷，安全性更高，具有广阔的临床应用前景。 2.应用同种异体的ASCs辅助脂肪移植，ASCs未受免疫排斥，能有效的促进脂肪移植物的存活，具备潜在的临床应用价值，目前国内外尚无此类文献报道。 3.新鲜分离的自体SVFs、培养的自体ASCs以及同种异体ASCs均参与并促进了移植物新生血管进程，是其提高脂肪移植物存活率的可能机制。

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文摘

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前 言

材料与方法

结 果

讨论

结论

参考文献

综述：脂肪干细胞在整形外科软组织填充术中的应用进展

攻读学位期间的成果

致谢