全血STAT1(Y701)磷酸化水平快速检测评估地塞米松对人体免疫的影响

摘要

目的: 由于JAK1-STAT1（Y701）信号传导途径在Th1细胞的分化与增殖过程中至关重要，所以其磷酸化水平可以被反映为Th1细胞功能。Th1细胞是一类专门分泌Th1类细胞因子的淋巴细胞亚群，在细胞免疫和移植物排斥反应中起到极其重要的作用。JAK/STAT是调节免疫反应的信号蛋白家族，其蛋白质磷酸化分子识别模式是受体蛋白直接与配体蛋白相藕连，快速介导蛋白质磷酸化，介导宿主防御反应、生长调控、凋亡等重要生理病理现象。在临床治疗过程中，常常使用大剂量的免疫抑制剂特别是皮质激素，然而，大剂量的免疫制剂极易导感染。另一方面，免疫抑制剂的使用不足又常常导致移植物排斥。本实验结果表明STAT1（Y701）磷酸化水平能够很好地反映免疫抑制剂特别是皮质激素（DEX）对免疫细胞的抑制情况：（1）DEX可以显著地抑制STAT1（Y701）的磷酸化水平，并呈现出很强的浓度依赖性；（2）低剂量免疫抑制剂组合中是否含有DEX对STAT1（Y701）的磷酸化水平的抑制具有显著的差异；（3）在多种低剂量免疫抑制剂联合应用时，比单独使用糖皮质激素（DEX）更能显著地抑制STAT（Y701）的磷酸化水平。 在具体检测方法方面，发现应用IFN-α1刺激外周全血的淋巴细胞后，应用流式细胞仪可以快速检测全血样本中淋巴细胞内STAT1（Y701）磷酸化水平，且该方法整个操作过程仅需要3小时，从而有利于临床医生根据检测结果及时调整药物用法，指导临床工作，降低排斥和感染的发生率，改善患者的存活并提高其生活质量。因此，在评估糖皮质激素对人体免疫功能的影响方面具有准确、简单和快速的特点。 方法： 招募20至40岁健康志愿受试者，抽取的外周静脉血用肝素抗凝，并真空管保存。定量的外周静脉血与一定剂量的免疫抑制剂共培养30分钟，再用刺激剂刺激15分钟，收集细胞以备流式检测。 磷酸化蛋白主要荧光标记的抗体pSTAT1（Y701）-PE、细胞表面决定族抗体CD3-FITC均从BD PharMingen 公司购买。干扰素-α1 作为STAT1（Y701）的刺激剂，购于San Diego，CA公司。红细胞裂解和免疫细胞固定用Lyse/Fix Buffer BD PharMingen ，而淋巴细胞破膜用Perm BufferⅢBD PharMingen 。染液是用0.2%的BSA 溶解于磷酸盐缓冲液（PBS）中配置而成，用来洗涤和重悬细胞。RAPA、FK506、CsA、DEX，和MPA均广泛应用于临床而被用来抑制免疫细胞活性。所有的药物均用PBS稀释成临床合适的浓度。 移液器每孔加入肝素化的全血50μl至96孔板（Greiner bio-one）中，并加入免疫抑制剂在37℃，5%CO2的条件下共培养30分钟。再加入刺激剂（IFN-α1）刺激15分钟。 全血培养后，5ul抗-CD3+加入50ul全血中培养10分钟，37℃，5%CO2用1.5mlEP管收集，并加入1ml预热的1×Lyse/Fix Buffer，10分钟，37℃，裂解红细胞和固定淋巴细胞。离心3分钟，300×g，并用0.5-1ml0.2%BSA染液清洗。100ul-20℃Perm BufferⅢ破膜，置于冰上30分钟后，洗两遍。加入5ul抗-STAT1（Y701）避光30分钟反应。用0.5-1ml0.2%BSA染液清洗，重悬，流式细胞仪检测。 标本用BD FACSCaliburTM流式细胞仪（San Diego，CA.）检测。CellQuest软件用来细胞计数，每一样本计数10000个细胞。FCE Express V3软件用于流式分析。细胞百分数作为研究对象。运用SPSS13.0统计软件行统计分析：单因素方差分析，LST（one-way ANOVA，LST）。 结果： 选择流式细胞仪作为检测STAT1（Y701）磷酸化水平工具，其它方法如，为ELISA，Western Blot和Luminex技术等方法因所需的检测时间过长或不能定量等不足均未被选用。虽然IFN-α和IFN-γ2均能显著增强STAT1（Y701）的磷酸化水平，但IFN-α1对淋巴细胞刺激效果更好，因而被选为刺激剂。我们应用不同浓度的IFN-α1（0、250、1000和2000U/ml）刺激15分钟。试验结果显示：500u/ml的IFN-α1即可较好地使STAT1（Y701）磷酸化。 STAT1（Y701）磷酸化能被高浓度（50ug/ml）的皮质激素（DEX）明显抑制，提示STAT1（Y701）磷酸化可作为长期或大剂量应用皮质激素（DEX）导致的免疫力低下、极易感染的检测指标[11]。而高剂量的RAPA（100ng/ml）和FK506（100ng/ml）也可轻度抑制STAT1（Y701）磷酸化[17]。单用60ug/ml MPA和30ug/ml CsA很难抑制STAT1（Y701）磷酸化水平。 应用不同浓度的DEX（0、5ug、25ug、50ug/ml）和50ul的全血共培养30分钟，运用流式细胞仪检测STAT1（Y701）磷酸化水平，结果显示：DEX对STAT1（Y701）磷酸化水平具有显著的浓度梯度抑制作用。 临床上，包含皮质激素的低剂量免疫抑制剂组合广泛应用于不同阶段的移植患者。因此非常有必要检测是否合并使用皮质激素（DEX）低浓度免疫抑制剂组对患者免疫细胞功能的影响。应用DEX+MPA； MPA+RAPA；DEX+MPA+RAPA； MPA+FK506； DEX+MPA+FK506； MPA+CsA； MPA+CsA+DEX （DEX：5ug/ml； MPA：30ug/ml； RAPA：10ng/ml； FK506：10ng/ml；CsA：3ug/ml）和50ul的全血共培养30分钟，5% CO2，37℃。运用流式细胞仪检测STAT1（Y701）磷酸化水平，结果显示：加入DEX的免疫抑制剂组合的对STAT1（Y701）磷酸化具有显著的抑制作用。 应用不同的低浓度免疫抑制剂组合DEX； DEX+ MPA； DEX+MPA+RAPA；DEX+MPA+FK506和DEX+MPA+CsA （DEX：5ug/ml； MPA：30ug/ml； RAPA：10ng/ml； FK506：10ng/ml； CsA：3ug/ml）和50ul的全血共培养30分钟，运用流式细胞仪检测STAT1（Y701）（Y701）磷酸化水平，结果显示：不同的低浓度的免疫抑制剂组合相比单用DEX对STAT1（Y701）磷酸化的抑制更强。 结论： 最近几十年以来，随着器官移植技术的进步，移植物和患者的存活时间均显著延长。但是，由于患者长期依赖于多种免疫抑制的联合治疗，免疫抑制治疗的的各种不良反应已逐渐出现。但其中最主要的问题是：（1）免疫抑制剂种类和剂量的应用是否合适；（2）如何评价患者的免疫系统状态。因此若免疫抑制剂使用过量，则免疫抑制过度，易导致感染；相反，免疫抑制不足则易引起各种排斥反应。目前，虽然部分免疫抑制剂的血药浓度的检测已广泛应用于临床，但此方法只能反应个别药物的局部剂量，却不能反应免疫细胞的功能。免疫抑制剂浓度高，不一定意味着免疫细胞的活性低；相反，免疫抑制剂浓度低，也不表示免疫细胞的活性高。一直以来，免疫细胞的STAT1（Y701）的磷酸化水平的检测缺乏准确而快速的检测方法，常用方法如Westernblotting只能半定量，并且耗时。相比Westernblotting，流式细胞术能更准确和更敏感地检测不同免疫细胞内STAT1（Y701）磷酸化水平。该方法操作过程简便，仅仅只需要3小时，与其他检测方法相比大大减少了工作量和检测时间。与此同时，标本来源的选择非常重要。全血标本可最大限度地减少了体外干扰因素，更好地模仿体内情况。因而，利用全血标本检测淋巴细胞内STAT1（Y701）磷酸化水平，能够更准确地反映患者的免疫状态。 此方法亦可应用于肿瘤、自身免疫疾病、过敏性疾病、肾病患者和长期或大剂量应用皮质激素的患者的免疫状态的评估。目前，放化疗是肿瘤患者的主要治疗手段，而自身免疫疾病、过敏性疾病和肾病患者均需要大剂量应用皮质激素，都伴随着免疫抑制带来的严重的感染风险。因此应用STAT1（Y701）磷酸化水平评估免疫状态可以更加合理地应用免疫抑制疗法，提高临床治疗效果。 目前，临床广泛应用联合免疫抑制治疗，目的是提高免疫抑制效果的同时减少副作用。而STAT1（Y701）磷酸化水平能够反映免疫抑制剂联合应用的情况吗？实验结果显示：低剂量免疫抑制剂组合中是否含有DEX对STAT1（Y701）的磷酸化水平的抑制具有显著的差异；在数种低剂量免疫抑制剂联合应用时，糖皮质激素（DEX）也能显著影响STAT（Y701）的磷酸化水平。因此STAT1（Y701）磷酸化能够很好地反映免疫抑制剂特别是皮质激素（DEX）对免疫细胞的抑制情况。临床医师可以根据STAT1（Y701）磷酸化的水平准确地判断免疫抑制剂的抑制水平从而减少排斥和感染。 总之，外周全血在IFN-α1刺激后，利用流式细胞术的方法可以准确和敏感地检测STAT1（Y701）磷酸化水平。同时，STAT1（Y701）磷酸化水平可以反映单个免疫抑制剂特别是皮质激素（DEX）或联合使用免疫抑制剂对免疫细胞功能的影响。此外，整个检测过程操作过程简单快速。将来临床医师有可能据此而调整免疫抑制剂的种类和剂量来提高治疗效果，减轻患者痛苦。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分：概述

第二部分：实验方法与过程

第三部分：结果

第四部分：讨论

参考文献

综述：Title: Evaluation of Clinical Immune Status by Cytokine Profiles and STAT Phosphorylation levels

研究成果

致谢

统计学审稿证明