虎杖苷对烧伤后创面愈合的治疗作用及机理

摘要

背景：药用的虎杖(polygonum cuspidatum sieb.etzucc)为蓼科蓼属多年生草本植物虎杖的干燥根茎和根(叶也入药)，主要含有蒽醌类化合物白藜芦醇苷、水溶性多糖和鞣质等成分，性味微寒微苦，归肝、胆、肺经，有祛风利湿、散瘀定痛、止咳化痰之功效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、关节痹痛、经闭经痛、水火烫伤、跌打损伤等。虎杖多年来一直是烧伤、创伤创面愈合治疗方剂中的一味主药。虎杖苷(polydatin，PD)是虎杖的有效活性成分，是从中所提取出的5种结晶中的第4种，又名虎杖4号或白藜芦醇甙。其化学名为3，4’，5-三羟基芪-3-β-D-单葡萄糖苷(3，4，5-trihydroxystilbene-3-β-mono-D-glucoside)。众多实验研究显示虎杖苷具有多个靶点的药理作用，如：抗氧化作用；减少细胞因子、炎性介质分泌；改善微循环血流及凝血状态；减少白细胞与内皮细胞的粘附等。
　　 烧伤后创面愈合过程是长时间大量细胞相互作用的结果。早期炎性细胞自循环进入局部损伤部位，单核细胞活化为巨噬细胞，在创面愈合中扮演重要角色，包括水解酶释放、吞噬作用以及分泌各种细胞因子和生长因子，反过来调控各种细胞的相互作用。随后，这些生长因子触发活化成纤维细胞和角质形成细胞，炎症阶段随后进入合成阶段。在这个阶段，血管完整性得以重建，软组织缺损被成纤维细胞产生的新结缔组织填平，新生上皮覆盖创面。这些过程是相互依赖的，胶原合成与新生血管形成同时发生，从而形成由毛细血管、成纤维细胞、炎性细胞、基质蛋白共同组成的肉芽组织。由于活化的巨噬细胞、中性粒细胞、血小板产生的细胞因子和生长因子的作用，成纤维细胞由周围组织迁移入创面，产生由胶原蛋白、葡胺聚糖、蛋白聚糖及弹力蛋白共同组成的基质，胶原蛋白逐渐成为主要基质蛋白。愈合的最后阶段时是上皮化，包括表皮细胞从创面边缘到创面的迁移、增殖和分化。
　　 虎杖苷经过本室30余年研究，作为静脉注射剂已取得国家Ⅰ类新药临床试验批件(国家食品药品管理局批件号2006L00301)，现已进入Ⅱ期临床试验，但虎杖苷是否适合皮肤烧伤创面治疗，是否有利于烧伤创面修复，尚未见报告。烧伤后创面缺血再灌注损伤、血管通透性改变、炎细胞浸润、炎性介质及生长因子分泌等病理改变，而虎杖苷的抗炎、抗自由基、改善微循环的效应为虎杖苷应用于烧伤创面治疗提供了理论基础，使其有望成为大面积烧伤治疗的有效的临床药物。因此本课题集中探讨虎杖苷对烧伤创面愈合的疗效和机理。
　　 目的：(1)研究不同浓度虎杖苷成纤维细胞生物学特性的影响；(2)研究不同浓度虎杖苷对角质形成细胞生物学特性的影响；(3)研究虎杖苷对大鼠烧伤创面的治疗作用及机理。
　　 前两项研究查明虎杖苷对烧伤创面修复的两个主要细胞(成纤维细胞和角质形成细胞)生长和合成功能影响，确定促进细胞增殖和引起细胞凋亡的虎杖苷浓度，从而为配制治疗烧伤的虎杖苷凝胶打下基础，也为虎杖苷凝胶的治疗机制提供细胞学依据。
　　 后一项研究查明三个浓度的虎杖苷凝胶对烧伤创面修复的效应，以空白凝胶作为阴性对照，以表皮细胞生长因子凝胶和磺胺嘧啶银作为阳性对照。
　　 方法：(1)原代培养人成纤维细胞3例，取第2代用于实验。选用含有10-6、10-5、10-4、10-3、10-2mol/L不同浓度虎杖苷的培养液作用于细胞72h，以未加虎杖苷的培养液作为对照。MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡；ELISA法检测上清中FN、C0Ⅰ、C0Ⅲ的分泌情况；RT-PCR检测FN、C0Ⅰ、C0ⅢmRNA的基因表达情况。(2)选用HaCat细胞株，用含有10-6、10-5、10-4、10-4、10-2mol/L不同浓度虎杖苷的培养液作用于细胞72h，以未加虎杖苷的培养液作为对照。MTT法检测细胞增殖情况；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡；流式细胞仪检测整合素β1的表达。(3)选用84只SD大鼠，于背部共复制168个深Ⅱ°烧伤创面，将其随机分为低、中、高浓度虎杖苷凝胶组、表皮细胞生长因子凝胶组、磺胺嘧啶银组及空白凝胶组。于伤后3天、7天、14天、痊愈、愈后1周及2周留取标本。观察各组动物愈合时间、不同时间创面愈合率。HE染色观察创面愈合过程。中性粒细胞计数、Western Blotting检测髓过氧化物酶(MPO)表达观察炎性细胞浸润情况。Masson染色、氯胺T法检测羟脯氨酸含量观察胶原合成情况。免疫组化CD31染色观察新生血管形成情况。六胺银染色观察痊愈创面基底膜重建情况。微循环仪检测不同时间段创面微循环的变化。(4)本实验所用数据均用采x±s表示，用SPSS(13.0版)统计软件包进行方差分析。
　　 结果：
　　 (1)中低浓度虎杖苷对成纤维细胞有促增殖作用，10-5、10-4mol/L组作用最明显。10-2mol/L组0A值大大下降，细胞生长受抑制。10-3mol/L组G1期细胞大幅度下降为83.09±4.42％，S期增至13.62±1.69％，细胞有S期阻滞现象。10-2mol/L组细胞凋亡率为85.39±11.74％，有明确的促凋亡作用。10-2mol/L组上清中C0Ⅰ、C0Ⅲ、FN的表达与其他各组比较均有统计学差异。C0Ⅰ、C0Ⅲ分别为61.49±3.42μ g/ml、945.05±38.79ng/ml，较其他各组显著性增高；FN为5.16±2.89ng/ml，较对照组显著性增高，较其他各组有所下降。10-2mol/L组中C0Ⅰ、C0Ⅲ、FNmRNA的分别为0.902±0.074、0.847±0.337、0.597±0.317，10-2mol/L虎杖苷有抑制C0Ⅰ、C0Ⅲ、FNmRNA表达的作用。
　　 (2)中低浓度虎杖苷对角质生成细胞有促增殖作用，10-4-10-3mol/L组作用最明显。10-2mol/L组0A值大大下降，细胞生长受抑制。这种促增殖作用有时间相关性。各浓度组对细胞周期影响不大。10-2mol/L组细胞凋亡率为72.19±16.63%，有明确的促凋亡作用。细胞整合素β1的表达随浓度升高逐渐增加，10-3mol/L组升至83.7±4.2％，10-2mol/L组大幅度下降至41.9±3.1％。
　　 (3)高浓度虎杖苷组(100μg/g)愈合时间22.9±2.3天，较其他各组均有提前；7天、14天愈合率较高，愈合加快。3、7、14天各浓度虎杖苷组中性粒细胞计数均少于其他各组，Western Blotting检测MPO表达情况与细胞计数一致。Masson染色显示各浓度虎杖苷组胶原增生开始较早，排列整齐；磺胺嘧啶银组胶原排列紊乱。氯胺T法测羟脯氨酸含量，其中磺胺嘧啶银组胶原表达最活跃。免疫组化检测CD31显示高浓度虎杖苷组、表皮细胞生长因子组及磺胺嘧啶银组新生血管密度高于其他各组，并持续至创面愈合。六胺银染色观察基底膜情况各浓度虎杖苷组均有不同程度基底膜重建，其中高浓度虎杖苷组最佳。微循环观察伤后外用高浓度虎杖苷凝胶有减轻水肿、改善微循环的作用。各浓度组伤后7天中心区血流有所恢复，14天见大量新生血管形成，至创面痊愈后1周，高浓度虎杖苷组血管接近正常水平，磺胺嘧啶银组新生血管数量仍较多，且排列紊乱。
　　 结论：
　　 (1)10-5-10-4mol/L为最适促成纤维细胞增殖浓度，不影响细胞周期及细胞外基质合成与分泌；10-3mol/L虎杖苷有S期阻滞作用；10-2mol/L组有明确的促凋亡作用，且抑制C0Ⅰ、C0Ⅲ、FNmRNA的表达。
　　 (2)10-5-10-3mol/L为最适促角质形成细胞增殖浓度，不影响细胞周期及凋亡，增加细胞表面整合素β1的表达；10-2mol/L组有明确的促凋亡作用，且抑制整合素β1的表达。
　　 (3)与空白凝胶阴性对照组及表皮细胞生长因子、磺胺嘧啶银阳性对照组比较，高浓度虎杖苷凝胶明显缩短愈合天数，加速创面愈合速度。主要作用机理为一方面通过减轻水肿、改善局部微循环、减少局部炎性细胞浸润、促进新生血管形成加速创面愈合；另一方面通过促进基底膜重建、调整胶原组织重塑改善愈合质量。
　　 全文小结：
　　 1.用细胞生物学和分子生物学方法，查明虎杖苷对烧伤创面两种主要修复细胞(成纤维细胞和角质形成细胞)的生长增殖、表达合成、细胞凋亡的影响。
　　 2.确定10-5-10-4mol/L·为虎杖苷最适的细胞生长浓度，并由此制备了低、中、高三个浓度(4μg/g，20μg/g，100μg/g)的虎杖苷凝胶，用于烧伤创面治疗。
　　 3.查明高浓度的虎杖苷凝胶(100μg/g)能加速烧伤创面愈合和明显缩短愈合时间，并探讨了其作用机制。确定虎杖苷凝胶是治疗烧伤创面一种新制剂。