低声压级次声对脑缺血再灌注后胶质纤维酸性蛋白、存活素表达的影响

摘要

[研究背景]
　　 脑卒中具有高发病率、高致残率的特点。中国每年新发脑卒中患者约200万人，其中以缺血性脑血管病最常见约占70-80％。对缺血脑组织及时进行溶栓实现再灌注是治疗缺血性脑卒中的有效措施，但是脑缺血再灌注后会引起一系列的层级反应，如微环境的紊乱、破坏血脑屏障、自由基代谢障碍、钙离子超载、炎症反应、线粒体稳定性的改变、细胞凋亡加速以及神经元、胶质细胞、突触、树突、轴突结构的改变等破坏作用。因此缺血组织再灌注以后抑制缺血周围神经元的凋亡，促进胶质细胞、突触和神经元之间的相互作用，对神经元的存活具有重要意义。近年来对脑缺血性卒中治疗除了包括早期溶栓等药物治疗外，随着现代医学的进步，康复治疗的早期介入也日益引起广大医务人员重视，并且取得明显效果。积极寻找有效促进神经功能恢复的干预方法以达到神经康复的目的，成为现在康复医学的新的研究热点，而且具有相当大的社会意义及可观的经济价值。目前主要的康复手段包括强制性被动训练、意向性功能训练、功能性电刺激、经颅磁刺激、脉冲磁疗及中国传统医学等综合康复手段。但是低声压级次声作为康复治疗的一种手段目前应用较少。
　　 次声是频率在0.0001～20Hz之间的机械振动波，而次声的生物学效应与次声强度有关，研究已经表明大强度的次声对机体，尤其对脑具有损伤作用，而小剂量次声的生物学效应并不十分清楚。依照“生物共振”理论，安全域范围的次声对人体的各种器官应有十分独特的作用，可能存在有利作用，因而在疾病诊疗方面存在巨大的开发潜力。90dB以下的小剂量次声与生物体可产生轻微共振。这是因为次声的频率低，不易被吸收，穿透组织细胞内产生的力学、声学、电学、光学等物理效应作用轻柔和缓，对生物体不仅不会产生损伤，反而对生物体产生按摩作用，对生物组织有益，能使病态组织内闭塞的血管重新开放，促进血液流动，改善病态血液循环，为氧气、吞噬细胞等物质向病态组织输送创造有利条件。次声的生物学效应表现在次声作用后，机体、组织器官、细胞结构及功能的变化上。
　　 有报道提出小剂量次声可以促进骨髓间充质干细胞增殖，也有外国学者报道较弱的次声作用下可伴有机体抗氧化系统酶活力增强，代偿反应增高等。另外美国CHI公司研制的次声8TM次声治疗仪可以随机发出低于90dB次声波，具有改善循环、增强免疫力、消炎、止痛及镇静安眠作用。近年来对次声的脑保护作用的研究越来越多，我们曾应用次声治疗仪Infrasound8TM产生的次声为干预因素，作用于脑缺血再灌注大鼠，结果证实了低声压级次声在每天作用120分钟，连续7天，可明显改善神经症状，缩小梗塞面积，并通过刺激IGF-1分泌从而起到脑保护作用;有人利用8Hz90dB和130dB次声作用于大鼠，每天2h，分别作用1、7、14、21、28d后发现次声使大鼠海马中GFAP阳性胶质细胞的数量增加，得出8Hz90dB和130dB次声可以激活大量星形胶质细胞，对神经元具有保护作用的结论。有研究发现对脑缺血再灌注损伤大鼠应用16Hz130dB次声预处理可明显减轻大鼠脑梗塞的容积，改善神经功能学评分。还有人在对低声压级次声对大鼠海马多聚唾液酸神经细胞粘附因子表达的影响研究中发现16Hz90dB次声作用可引起大鼠海马PSA-NCAM表达增强，提示低强度次声在导致中枢神经损伤同时，还能促使机体启动修复机制，增强神经干细胞迁移能力，从而参与次声性脑损伤的修复。
　　 星形胶质细胞是中枢神经系统中最多的细胞类型，约占正常成年人脑细胞总数的40％，发挥着重要作用。在脑缺血过程中，星形胶质细胞的增多是中枢神经的主要变化之一，随着对星形胶质细胞研究日益增多，越来越多的研究发现在中枢神经损伤后星形胶质细胞可通过维持离子平衡、清除兴奋性氨基酸、对抗氧化应激、调整能量代谢以及分泌多种神经营养因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、脑源性神经营养因子(BNF)、神经生长因子(NGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，保护受损神经元，增加突触联系，促进神经修复及神经功能恢复。
　　 存活素(survivin)是近年来发现的凋亡抑制蛋白，是IAP家族最小的成员，分子量只有16500，主要通过抑制凋亡蛋白caspase-3和caspase-7的活性而阻断凋亡过程。近年来对survivin的表达研究主要集中在肿瘤方面，对脑缺血后survivin的研究国内外均少见报道。研究发现在成人神经系统survivin主要表达于脉络丛、室管膜细胞、神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞中。有人研究大鼠的MCAO模型时发现，在缺血和缺血周围区域的脑组织及其相对应的脑膜上，毛细血管内皮细胞上survivin表达增加，血管的再生程度与survivin的表达程度具有一定的相关性，结果表明survivin作为凋亡抑制蛋白，主要通过抑制凋亡蛋白caspase-3和caspase-7的活性而阻断凋亡过程，是一种抗凋亡保护机制。
　　 [目的]
　　 探讨低声压级次声对大鼠缺血再灌注脑损伤后脑缺血周围胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、survivin的表达及神经行为学变化情况，进一步证明次声能够通过影响脑缺血后星形胶质细胞、抑制缺血周围神经元凋亡而起到脑保护作用。
　　 [方法]
　　 线栓法制作大脑中动脉脑缺血2h再灌注(MCAO)模型。将36只SD雄性大鼠分成假手术组(n=12)、次声组(n=12)和模型组(n=12)，每组再分为3d、7d两个亚组，每组6只。次声组在缺血再灌注12h后连续予次声干预2 h/d，模型组干预过程中除不开机外，其余过程同次声组，假手术组不做任何干预。在治疗3d、7d后（处死前）对大鼠进行神经功能(mNSS)评分，脑组织切片采用免疫组织化学方法观察脑缺血周围GFAP及survivin表达变化。
　　 [统计学方法]
　　 采用SPSS13.0版统计学软件进行分析。各组数据以（(x)±s）表示，在数据符合正态分布后，各组之间比较采用独立样本t检验，显著性水平α=0.05。
　　 [结果]
　　 1、假手术组术后基本正常，各时间点mNSS评定总分均为0分。次声组、模型组与假手术组比较均有神经功能损伤。次声3天组与模型3天组评分相比差异无统计学意义(P＞0.05);模型7天组与模型3组比较差异有统计学意义;而次声7天组与模型7天组评分相比差异有统计学意义(P＜0.05);次声7天组与次声3天组评分相比差异非常有统计学意义(P＜0.01)。
　　 2、胶质纤维酸性蛋白IOD值比较:假手术3、7天组偶见少量阳性表达，颜色较浅，突起纤细，IOD值较小。次声各组与模型各组GFAP阳性表达明显增多，着色深染，突起增多，尤其次声各组阳性表达更为明显。模型7天组较模型3天组表达具有显著统计学差异(P＜0.01);次声各组与相应模型各组比较差异均具有非常显著性统计学意义(P＜0.01);而次声7天组与次声3天组相比，差异也具有显著统计学差异(P＜0.01)。
　　 3、Survivin表达情况:假手术3、7组大脑组织仅少量表达，细胞数目较少，仅为基础表达，明显少于其他各组;脑缺血再灌注3天后缺血周围survivin强阳性表达，而随着时间延长表达减少，7天后survivin表达明显减少，模型3天组明显多于模型7天组(P＜0.01)，次声3天组的细胞个数也明显多于次声7天组(P＜0.01);次声组与模型组相比:次声3天组survivin的细胞数量明显多于模型3天组(P＜0.01)，次声7天组与模型7天组相比survivin细胞数量也明显增多(P＜0.05)。
　　 [结论]
　　 1、次声治疗7天能够显著降低mNSS评定总分，促进神经功能恢复。
　　 2、次声能够增强大鼠脑缺血再灌注后缺血周围GFAP的表达，而次声干预7天后增强较为显著。
　　 3、低声压级次声能增强缺血再灌注后survivin的表达，次声在脑缺血再灌注损伤后能够抑制脑缺血周围神经元的凋亡，是神经保护的一个重要机制。
　　 4、低声压级次声对脑缺血再灌注后大鼠具有神经保护作用。

目录

摘要

第一章 研究背景

第二章 实验部分

1．1 低声压级次声对脑缺血再灌注后大鼠行为学影响

1．1．1 材料及方法

1．1．2 统计学分析

1．1．3 结果

1．1．4 讨论

1．2 低声压级次声对脑缺血再灌注缺血周围GFAP的影响

1．2．1 材料及方法

1．2．2 统计学分析

1．2．3 结果

1．2．4 讨论

1．3 低声压级次声对大鼠脑缺血再灌注后缺血周围存活素表达的影响

1．3．1 材料及方法

1．3．2 统计学分析

1．3．3 结果

1．3．4 讨论

总结

参考文献

附录 英文缩略词表

附图

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