人肝细胞膜与乙型肝炎病毒相互作用蛋白筛选及其在HBV感染中的生物学意义研究

摘要

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）属嗜肝DNA病毒科，是已知感染人类的最小DNA病毒。HBV感染不仅可以引起急、慢性肝炎，而且还与肝硬化、肝癌的发生、发展密切相关。
　　 根据前期的研究成果，已知HBV表面抗原上的PreS1结构域是HBV感染必不可少的而PreS2则可能不是必需的。另外，PreS1结构域的一个重要特点是在Gly-2存在豆蔻酰化修饰，众多证据证明此修饰对HBV/HDV的感染是不可或缺的。本论文以豆蔻酰化的PreS/1-48为诱饵蛋白，通过应用Far-westen-2D结合质谱鉴定技术，从正常人肝细胞中筛选乙肝表面抗原相互作用蛋白，共获得了15个候选蛋白分子。通过文献调研，选择可能成为HBV感染相关的关键分子，即埃兹蛋白（Ezrin）作为下一步研究的目标蛋白。Ezrin是埃兹蛋白/根蛋白/膜突蛋白（ERM）家族成员之一，是一种膜细胞骨架连接蛋白，它在多种恶性肿瘤细胞中表达异常，已证实其在肿瘤的侵润、转移机制、抑制病毒复制等过程中发挥重要作用。
　　 本论文通过构建Ezrin的真核表达载体，并和LS-mye共表达于细胞中，采用免疫共沉淀实验证实Ezim和乙型肝炎病毒表面抗原（surface HBV antigens，HBsAg）存在相互作用。另外，通过纯化诱饵蛋白HBVPreS/1-48myr，采用GST-pull down技术也验证了这种相互作用的存在。在此基础上，本论文还研究了Ezrin在HBV感染中的作用。通过流式细胞术、细胞ELISA、荧光定量PCR等方法探索了Ezrin与HBsAg的相互作用对宿主细胞活性、凋亡、增殖、HBV粘附、进入等方面的影响。结果显示外源性Ezrin蛋白显著促进HBV颗粒的进入过程，并抑制HBsAg和HBeAg的胞外分泌，而Ezrin和LS的相互作用对宿主细胞不产生影响。
　　 综上所述，本研究筛选了人肝组织中和HBsAg具有相互作用的蛋白Ezrin，并研究了Ezrin和HBsAg之间的相互作用及其在HBV感染过程中的生物学意义。我们推测，Ezrin在HBV感染过程中表达下调，一定程度上阻止了HBV的感染，减少了HBV的进入，因而可视为一种防御机制；而外源性Ezrin具有促进HBV进入肝细胞的作用，推测其在HBV进入肝细胞的过程中起着胞内辅助性受体的作用；并且本论文初步发现，外源性Ezrin具有抑制HBsAg，HBeAg胞外分泌的作用。本文为解释HBV吸附并进入细胞的机理和基于病毒与宿主相互作用的新型抗HBV药物的开发提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

第一章 绪论

1．1 HBV简介

1．2 HBV感染致病关键分子及潜在宿主靶点研究进展

1．2．1 当前抗HBV药物研究现状及宿主靶标学术思想的提出

1．2．2 HBV相互作用蛋白研究进展

1．2．3 乙肝病毒研究中尚未解决的关键问题

1．2．4 Ezrin的研究概况

1．3 本研究的目的意义

第二章 材料与方法

2．1 主要试剂及来源

2．2 主要仪器与设备

2．3 菌株与载体质粒

2．4 细胞株和细胞培养

2．5 主要溶液及配制

2．5．1 常用试剂

2．5．2 细胞培养用相关试剂

2．5．3 细菌培养用相关试剂

2．5．4 DNA/RNA分析试剂

2．5．5 蛋白质分析试剂

2．6 引物

2．7 GST—HBVPreS/1—48myr与GST融合蛋白诱导表达

2．8 GST—HBVPreS/1—48myr与GST融合蛋白的纯化

2．9 人肝膜蛋白的提取

2．10 双向电泳

2．11 Far—Western

2．12 Ezrin基因片段的真核表达质粒的构建

2．13 细胞转染

2．14 从细胞中提取蛋白和定量

2．15 GST沉降(pulldown)分析

2．1 6 免疫共沉淀

2．17 Western印迹(Western blot)

2．18 总RNA的提取

2．19 RT—PCR

2．20 流式细胞术分析细胞周期

2．21 细胞增殖及毒性检测

2．22 细胞凋亡分析

2．23 细胞培养液中HBsAg、HBeAg的ELISA检测

2．24 HBsAg病毒颗粒的提取

2．25 ELASA检测HBsAg对细胞的粘附

2．26 荧光定量PCR检测Ezrin对HBV进入的影响

第三章 结果与分析

3．1 乙肝病毒表面抗原PreS1相互作用蛋白筛选和验证

3．1．1 HBVPreS/1—48myr与GST融合蛋白表达纯化

3．1．2 Far—Western—2D筛选和质谱鉴定

3．1．3 重组质粒pCMV—HA—Ezrin的构建及鉴定

3．1．4 GST—沉降分析Ezrin与HBVPreS/1—48myr之间的相互作用

3．1．5 免疫共沉淀分析Ezrin与LS之间的相互作用

3．2 Ezrin在HBV感染过程中的生物学功能意义的研究

3．2．1 Ezrin在HepG2、2．2．15、L02细胞中表达变化

3．2．2 Ezrin对HBV感染后细胞培养液中HBsAg和HBeAg的影响

3．2．3 Ezrin与LS的相互作用对细胞增殖的影响

3．2．4 Ezrin与LS的相互作用对细胞凋亡的影响

3．2．5 Ezrin与LS的相互作用对细胞周期的影响

3．2．6 Ezrin对细胞粘附和HBV进入的影响

第四章 讨论与结论

4．1 Ezrin与乙肝病毒表面抗原PreS1的相互作用

4．2 Ezrin在HBV感染过程中的生物学意义

4．2．1 Ezrin促进HBV进入细胞

4．2．2 初步证明Ezrin对HBsAg，HBeAg胞外分泌具有抑制作用

4．2．3 Ezrin与LS的相互作用对细胞凋亡/周期/增殖无影响

4．3 全文总结

参考文献

致谢

主要符号对照表

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