酿酒酵母表面展示人自身免疫性肝病抗原及其应用研究

摘要

酵母表面展示体系能够展示糖基化和二硫键异构化等修饰的真核蛋白,蛋白在酵母细胞表层可直接利用流式细胞仪检测,进行活性分选,通过一步离心即可分离获得表达的蛋白,易实现高通量筛选。酵母表面展示体系已经成功的应用于筛选抗体、抗体酶和其他生物因子,但稳定的蛋白表面展示还受到多种因素的影响。目前,自身免疫性疾病(AID)的诊断和治疗均需要高效价的自身抗体和抗体药物,而检测和分析AID的自身抗体有助于免疫病理机制研究。而现有的抗体检测和抗体制备方法均离不开高纯度的抗原,有限的获得方法和复杂的操作过程影响了抗体的生产和应用。 基于对抗体生产的需求和研究人自身免疫性肝病的重要性,本论文从Human Fetal Liver Creator SMART cDNA Library中扩增了7个人自身免疫性肝病相关抗原的基因,插入带His.tag标签的酵母表面展示载体pICAS-H中,获得7个重组质粒,在Genbank的人源基因组数据库中通过BLAST比对重组质粒的测序结果,发现克隆基因与同源性最高序列的最大相似度均在99％以上；再将重组表面展示载体整合到酿酒酵母宿主MT8-1的基因组上,构建了表面展示人自身免疫性肝病抗原的7株重组酵母菌。 分别诱导培养7株重组酵母菌,用免疫荧光染色,通过流式细胞仪和荧光显微镜检测,证明克隆的7个抗原蛋白均成功展示于酵母表面；展示抗原GST Al和ProI的重组酵母整体细胞呈现高效表达,展示抗原AGSPR1、BIR5、G2C B1、CK8和PSA6的重组酵母部分细胞呈现高效表达。从7株重组酵母菌的培养情况发现,重组质粒的导入对宿主菌的生长规律没有太大影响,外源基因的导入与表达对细胞的生长没有带来根本性的改变。用YPD、SD和SA培养重组酵母,发现在对数生长末期(24 h)重组酵母展示目的抗原的表达率最高,而且用SA培养基培养重组酵母获得抗原的展示表达率高于另外两种培养基培养。优化培养基成分后发现相对大部分展示抗原的重组酵母而言,选取含3％的酸水解干酪素和2％的葡萄糖的SA培养基培养,可获得较高的展示表达率。 用酵母表达谱基因芯片在转录水平上研究外源基因的插入及不同培养条件对酿酒酵母基因表达的影响,发现外源基因的插入后上调最明显的基因为SAG1和TRP1,还有参与细胞壁合成、胞内蛋白的合成、液泡融合和能量合成等基因,而下调基因主要集中在线粒体的合成与代谢、糖类合成、氨基酸合成与代谢、物质运输、动态调节等生物过程。不同培养条件下产生的差异基因主要参与蛋白质合成、新陈代谢、能量合成、胞内运输、代谢调节和辅助调节蛋白功能等生物学过程。培养基SD培养中蛋白质合成和新陈代谢相关基因出现上调,蛋白质修饰、折叠相关基因出现下调。差异表达基因主要集中于糖酵解、戊糖途径、TCA循环、氨基酸合成与脂肪酸代谢等途径。糖酵解途径受培养基SD与SA的培养影响明显的基因不多,戊糖循环途径和TCA循环在SA培养中明显上调,TCA循环在SD培养中呈现下调。通过建立新的免疫荧光法和Yeast-ELISA的方法将酵母展示抗原颗粒CK8、PSA6和AGSPR1抗原成功应用于单抗和多抗的检测；并进一步用重组酵母展示的Profilin Ⅰ抗原检测杂交瘤细胞培养上清和腹水中的对应抗体,筛选阳性杂交瘤细胞株,获得了2株可生产Profilin Ⅰ特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。结合DNA免疫技术,证明了无蛋白抗原制备抗体方法的可行性。 本研究通过构建7株展示人自身免疫性肝病抗原的重组酵母,获得优化的稳定表达条件,建立了一个稳定、快速的酵母表面展示抗原的技术平台,并成功应用其中的几种酵母展示抗原替代传统的蛋白抗原,进行抗体检测和抗体筛选。利用酵母表达谱基因芯片分析外源蛋白插入和培养条件对酿酒酵母基因表达的影响,对进一步从转录水平上优化表达具有重要意义。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1酿酒酵母表面展示系统的研究

1.1.1概述

1.1.2酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞表面结构

1.1.3酵母锚定蛋白(GPI)

1.1.4酵母GPI锚定蛋白的分泌途径

1.1.5酵母表面展示系统类型

1.1.6酿酒酵母表面展示系统的特点

1.1.7酵母表面展示系统的应用

1.2人自身免疫性肝病的研究

1.2.1概念

1.2.2发病机制和临床易感性研究

1.2.3诊断和治疗方法现状

1.3人类肝脏蛋白质组计划

1.4人类肝脏蛋白单克隆抗体库

1.5抗体生产的研究现状

1.6基因芯片技术及其应用研究

1.6.1基因芯片技术基本原理

1.6.2基因芯片的技术环节及其应用

1.7本实验的研究背景、意义和主要研究内容

1.7.1研究背景与意义

1.7.2主要研究内容

1.7.3技术路线

第二章人自身免疫性肝病相关抗原基因的克隆

2.1引言

2.2实验材料

2.2.1主要仪器设备

2.2.2质粒与菌株

2.2.3主要试剂

2.2.4培养基与常用溶液

2.3实验方法

2.3.1细菌的培养

2.3.2 DNA浓度测定

2.3.3大肠杆菌质粒的提取

2.3.4 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2.3.5 PCR产物纯化

2.3.6 DNA的酶切

2.3.7酶切后目的产物的凝胶回收

2.3.8体外连接

2.3.9大肠杆菌感受态细胞的制备

2.3.10大肠杆菌的转化(化学法)

2.3.11大肠杆菌的转化(电转化)

2.3.12酵母表面展示抗原载体的构建

2.4结果与讨论

2.4.1七种人类自身免疫性疾病抗原的选择与相关信息

2.4.2酵母表面展示载体的改造

2.4.3酵母表面展示重组载体的构建

2.5本章小结

第三章人自身免疫性肝病抗原在酿酒酵母表面的展示

3.1引言

3.2实验材料

3.2.1主要仪器设备

3.2.2菌株

3.2.3主要试剂

3.2.4培养基与常用溶液

3.3实验方法

3.3.1重组质粒转化酿酒酵母宿主(醋酸锂法)

3.3.2重组酵母的诱导培养

3.3.3重组酵母的预处理

3.3.4重组酵母展示抗原免疫荧光检测法

3.4结果与讨论

3.4.1重组表达载体转化酵母细胞

3.4.2重组酵母转化子的菌落PCR鉴定

3.4.3重组酵母抗原蛋白的表面展示

3.4.4单克隆抗体检测酵母展示抗原CK8

3.4.5多克隆抗体检测酵母表面展示抗原ASGPR1

3.5本章小结

第四章酵母表面展示人自身免疫性肝病抗原的研究

4.1引言

4.2实验材料

4.2.1主要仪器设备

4.2.2质粒与菌株

4.2.3主要试剂

4.2.4培养基与常用溶液

4.2.5酵母基因组微阵列芯片

4.3实验方法

4.3.1重组酵母的诱导培养

4.3.2重组酿酒酵母菌生长曲线的测定

4.3.3重组酵母的预处理

4.3.4重组酵母展示抗原免疫荧光检测法

4.3.5酵母菌RNA的抽提

4.3.6 RNA的甲醛变性胶电泳

4.3.7对样品RNA进行荧光标记

4.3.8杂交与清洗

4.3.9芯片扫描、图像的采集与数据分析

4.4结果与讨论

4.4.1酿酒酵母生长曲线的测定

4.4.2培养基对重组酵母展示表达抗原的影响

4.4.3酸水解干酪素对重组酵母展示表达抗原的影响

4.4.4葡萄糖对重组酵母展示表达抗原的影响

4.4.5外源基因插入对酿酒酵母MT8-1的基因表达的影响

4.4.6培养基对重组酿酒酵母MT8-1/pICAS-H-PSA6的基因表达的影响

4.4本章小结

第五章酵母展示人自身免疫性肝病抗原的应用

5.1引言

5.2实验材料

5.2.1主要仪器设备

5.2.2质粒与菌株

5.2.3主要试剂

5.2.4培养基与常用溶液

5.3实验方法

5.3.1重组酵母的诱导培养和预处理

5.3.2免疫荧光法检测抗体

5.3.3酵母展示抗原-酶联免疫吸附法(Yeast-ELISA)检测抗体

5.3.4 Profilin Ⅰ的单克隆抗体制备过程

5.4结果与讨论

5.4.1抗人源蛋白酶体α亚基6的单克隆抗体的检测

5.4.2抗人源Profilin Ⅰ抗体的检测

5.5本章小结

结论与展望

结论

本论文的创新之处

展望

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的研究成果

致谢