壳聚糖微载体的制备及在细胞培养中的应用研究

摘要

微载体细胞培养是一种实现贴壁型细胞在生物反应器中大规模悬浮培养的先进技术。该技术在国外早已成功被应用于多种疫苗、生物酶等生物制品的生产中。近年来，该技术逐渐在我国生物制药企业中兴起并推广。然而我国微载体的开发起步较晚，目前国产化微载体相对较少，市售的商品化微载体主要依赖进口，价格昂贵。因此，研究并开发适用于动物细胞培养的微载体仍然是我国生物制药领域的一个重要课题。作为一种性能优良的天然高分子聚合物，壳聚糖来源丰富、价格低廉、生物相容性好，已在生物医药、废水处理等领域得到广泛的应用。
　　本文在前人研究的基础上，以壳聚糖为原料，用乳化交联法制备了一种还原型壳聚糖微载体，解决了壳聚糖微球经戊二醛交联后存在的细胞毒性残留问题，使其更适合于动物细胞的贴附与生长，满足细胞培养的需要。
　　论文在参照进口 Cytodex1微载体的技术指标基础上，对制备的还原型壳聚糖微载体从工艺参数上进行了优化，对其粒径分布、表面特征、每克干球的微球数和比表面积、膨胀体积等参数及高压灭菌性能等方面进行了优化，得到了半透明、表面较光滑、轻微搅拌既能悬浮的还原型壳聚糖微载体，其粒径分布在110~210μm之间，平均粒径185um,每克干重的微球数达到2.1~2.5×106个/g，每克干重的表面积可达2256~2686cm2，膨胀体积10~11mL/g，比重1.07g，能够耐受121℃30min的常规高压灭菌，连续高压5次不变形，同时能够耐受0.25％胰蛋白酶的消化，性质稳定；以上指标表明，通过乳化交联法制备的还原型壳聚糖微载体，粒径较均匀，可用常规方法进行高压灭菌，在液体中呈淡黄色半透明状，细胞在其表面生长后，可直接在光学显微镜下观察细胞生长状态。接下来对制备的还原型壳聚糖微载进行了理化性质的检测。以进口 Cytodex1微载体为对照，以3g/L载体量和1.6×105cells/mL的细胞密度接种，在125mL悬浮培养瓶中对叙利亚地鼠肾细胞（BHK-21）、中华仓鼠卵巢细胞（CHO）和恒河猴肾细胞（Marc-145）这三种疫苗生产常用的细胞进行壳聚糖微载体培养。结果表明：BHK-21、CHO、Marc-145这三种疫苗生产常用贴壁细胞在其上均能良好生长，自制的壳聚糖微载体可以作为培养上述三种贴壁依赖型动物细胞的微载体使用。

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第1章 绪 论

1.1 微载体

1.2 壳聚糖

1.3 论文工作的提出与创新

第2章 壳聚糖微载体的制备

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论

2.5 本章小结

第3章 壳聚糖微载体的理化性质检测

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果与分析

3.4 讨论

3.5 本章小结

第4章 壳聚糖微载体在动物细胞培养中的应用

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果与分析

4.4 讨论

4.5本章小结

全文结论

下一步工作构想

参考文献

缩略词英文对照表

致谢

附录A(攻读硕士学位期间所发表的论文）