苛求芽孢杆菌尿酸酶的表征、应用与其基因克隆

摘要

测定血清尿酸是临床检验常规工作之一。利用尿酸酶的高专一性进行酶法分析测定血清尿酸含量，即尿酸酶法，是目前常规测定血清尿酸的主要方法。现有尿酸酶法中，过氧化物酶偶联尿酸酶的间接终点平衡法最常用，但此终点平衡法受血清中还原物质和过氧化物，及黄嘌呤等的显著干扰。本实验室在国家自然科学基金(30200266)资助下，建立了血清尿酸含量测定的专利方法(zl03135649．4)，此专利方法对血清中常见干扰物质不敏感；与其它尿酸酶法相比，相同效率下其成本最低，线性范围最宽，对黄嘌呤抗性最强。已报道尿酸酶法中，测定尿酸酶作用下紫外吸收总变化的直接终点平衡法对常见干扰抗性最强。本实验室的专利方法与直接终点平衡法一致，但与最常用的过氧化物酶偶联尿酸酶间接终点平衡法不一致。可见此专利方法可行且可靠。但此专利方法需要Km较高且对黄嘌呤抑制不敏感的工具尿酸酶。目前市售尿酸酶Km都较低且对黄嘌呤敏感。另一方面，尿酸酶也是当前治疗高尿酸血症相关疾病的理想药物。苛求芽孢杆菌依赖于高浓度尿酸而生长，其可表达高比活性的胞内和胞外尿酸酶；此类尿酸酶Km较高，最接近我们专利方法要求；但至今未见关于此物种的任何基因序列信息报道。为获得廉价且符合要求尿酸酶以促进测定血清尿酸含量专利方法的应用，并进一步开发治疗高尿酸血症的自主知识产权药物，本项目对苛求芽孢杆菌的胞内外尿酸酶进行了下列研究： 1．苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶用于此专利方法测定尿酸的评价 用高尿酸诱导培养苛求芽孢杆菌(ATCC26904)，所分泌胞外尿酸酶经硫酸铵沉淀和DEAE-cellulose52层析，就可用于此专利方法通过预测反应体系紫外吸收本底，动力学法测定血清尿酸。结果发现，此尿酸酶含34．7M单一肽链，Km为(O．22±0．01)mmol／L(n=11)，黄嘌呤抑制常数为(36±3)p,mol／L(n=4)。此尿酸酶用于我们的专利方法，只要被分析数据终点对应底物浓度低于被分析起点底物浓度的35％，就能可靠预测本底。通过直接测定酶作用前吸收，此直接动力学法对常见干扰、酶活性变化和15gmol／L黄嘌呤有抗性。用0．025U／mi尿酸酶监测反应5min内数据对应测定下限为1μmol／L，上限接近50μmol／L，所得临床标本尿酸含量(CdO与过氧化物酶偶联间接终点平衡法(Cie)紧密正相关(Cdk=-0．008+1．046xCie，r>0．996，n=206)，但Bland-altman分析表明其与过氧化物酶偶联尿酸酶的间接终点平衡法不一致。因此，此苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶能用于直接动力学尿酸酶法测定血清尿酸含量，并保障其优势。但此酶制剂含有色素，须高纯度才能用于此专利方法，而且此酶可能含有金属离子辅助因子，重组表达难度也较大。 2．苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶用于专利方法测定血清尿酸的评价 用高尿酸诱导培养苛求芽孢杆菌(ATCC26904)，离心收集菌体，超声破碎，离心后上清液经DEAE-cellulose52层析，再经过制备性凝胶电泳纯化后纯度达95％。用SephadexG-200凝胶过滤层析测得有活性天然尿酸酶分子量为151kd，SDS-PAGE发现其由35．7kd单一肽链组成，MALDI-TOF-MS分析发现其只有35．983kd的主峰，用Edman降解法测得该尿酸酶的N．端氨基酸序列为AERTMFYGKGDV。此酶对水透析后解离成二聚体而失去活性。该尿酸酶最适pH为9．0-10．5：pH为9．2时Km为(204士14)gmol／L(n=8)，黄嘌呤抑制常数为(41~7)grnol／L(n=5)。此尿酸酶用于直接动力学尿酸酶法，分析0．03U／ml尿酸酶反应5min内的数据可预测本底，在反应体系中尿酸测定下限达到1μmol／L，上限接近50μmol／L，且对反应体系中30μmol／L的黄嘌呤干扰有抗性。所得临床标本尿酸含量(CaA)与过氧化物酶偶联双试剂间接终点平衡法(Cie)紧密正相关(Cie=0．017+0．919×cak，r>0．998，n=189)，与测定尿酸酶作用下紫外吸收总变化的直接终点平衡法(Cae)也紧密正相关(Cak=一0．018+1．007×Cae,r>0．998，n=189)，间接终点平衡法(Cie)和直接终点平衡法(Cde)也紧密正相关(Cie=-0．001+0．927×Cde，r>0．997，n=l89)。Bland-Akltman分析表明，此专利方法与直接终点平衡法一致，而与间接终点平衡法不一致。用此苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶，此专利动力学尿酸酶法比其它尿酸酶法线性范围更宽，相同效率下成本最低，抗干扰能力更强，尤其对黄嘌呤的抗性为最强。此胞内酶不含色素，用于此专利尿酸酶法测定血清尿酸含量更合适，而且此酶不需金属辅助因子，也容易实现其重组表达。 3．苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的基因克隆 用BLAST(searchforshort，nearlyexactlymmhches模块)搜寻NCBI数据库，发现该尿酸酶N端已知序列与BacillushaloduransC-125的N端相似性最高，与Bacillussp．TB-90相似性次之；来自细菌的活性尿酸酶含有310～340个氨基酸残基。对相似性最高的几种细菌尿酸酶进行多序列联配比对分析，发现细菌尿酸酶有两个保守肽段：MN端约70个氨基酸处存在ATDSMKNFI保守肽段，距N端约290个氨基酸处存在GKVYTEPR保守肽段(以Bacillussp．TB-90尿酸酶的氨基酸序号为参考)。据已知N端序列设计简并引物作为5端引物，针对两处的保守序列设计简并引物为3端引物，分别组合后优化退火温度进行PCR扩增，获得了来自基因组DNA的多个片段；所得DNA片段经T载体连接，转化后蓝白斑筛选，阳性克隆初步验证插入序列后，测序得N端75个氨基酸对应基因片段；BLASTp搜索NCBI数据库发现其与Bacillussp．TB-90尿酸酶N端片段的相似性最高；同时，在用N端已知序列对应简并引物和针对下游保守序列简并引物进行PCR克隆所得片段中，意外地发现了从距天然蛋白N端59个氨基酸残基到翻译终止密码子下游的全序列；通过针对已知序列的全长克隆，确认了从第5位氨基酸到终止密码之间的编码区基因序列，翻译后发现该尿酸酶总共含322个氨基酸残基，分子量35．757kd；用BLASTp搜索NCBI数据库发现，其序列与Bacillussp．TB-90尿酸酶序列相似性最高(＞57％)，同Bacillussubtilissubsp．subtilisstr.l68尿酸酶序列相似性排第二，与BacillusclausiiKSM-K16尿酸酶序列相似性排第三，与BacillushaloduransC．125尿酸酶的序列相似性排第四；在此尿酸酶靠近N端70个氨基酸残基附近存在上述细菌尿酸酶中保守序列ATDSMKNFI，而其他细菌尿酸酶靠近下游(距离N端约290个氨基酸处)的另一保守序列，在该尿酸酶变为G＃＃＃＃＃＃R，这可能是简并引物PCR扩增未能直接得到从N端到此远端保守序列对应基因片段的原因。在用简并引物PCR扩增时，还非特异地扩增出三个该菌株的其他蛋白基因片段，序列已提交GenBank(序列号为DQ464200～464202)。根据此酶的氨基酸序列，用InsightⅡ下的Homology模块建立了其三维结构模型，发现70个氨基酸附近的保守序列和N端片断位于竞争性抑制剂(或底物)结合区域，290个氨基酸附近的保守序列伸展到单体外部，处于与其它亚基结合的界面。这些结构特点可能与此尿酸酶在低离子强度时失活有关。据上述结果初步认为已得苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的氨基酸全序列和其基因编码区碱基序列，这为该尿酸酶鉴定、基因工程表达、用于本实验室的尿酸测定专利方法和开发治疗高尿酸血症蛋白药物奠定基础。

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符号说明

前言

第一部分苛求芽孢杆菌胞外尿酸酶的表征及在血清尿酸测定中的应用

第二部分苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的表征及在血清尿酸测定中的应用

第三部分苛求芽孢杆菌胞内尿酸酶的基因克隆

全文总结

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文