人胰高血糖素样肽-1与人血清白蛋白在毕赤酵母中的融合表达

摘要

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一种肠促胰岛素，它作为人体内功能性多肽，是迄今能诱导胰岛素分泌的最强物质，可以促进胰岛素基因转录和胰岛素分泌，提高受体对胰岛素的敏感性，消除胰岛素抵抗引发的各种并发症，其最显著的功能是促进胰岛β-细胞功能再生，防止胰岛凋亡[1，2，3]，明显改善糖尿病人的血糖水平。 如前所述，GLP-1能通过刺激胰岛β细胞的增殖和新生，使β细胞数晕增加，对Ⅱ型糖尿病的治疗具有重要的意义。但GLP-1在体内被二肽基肽酶(dipeptidy 1 protease Ⅳ，DPP-Ⅳ)水解后，形成无活性的GLP-1(9-36)NH2，成为胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1receptor，GLP-1R)的体内天然拮抗剂，因此它在体内的半衰期不足5分钟。其短的体内半衰期决定了只有频繁、反复地给药才能取得令人满意的疗效，这一点极大地限制了GLP-1的临床应用。而且化学合成hGLP-1不仅成本高，而且合成产率低，不利于产业化规模生产。为此，本论文构建了人胰高血糖素样肽hGLP-1的突变体基因2Gly-hGLP-1，并使之与人血清白蛋白HSA进行融合，由于大肠杆菌和哺乳动物细胞表达系统具有明显的缺陷，因此本课题选用比较成熟的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌表达系统，使2Gly-hGLP-1-HSA融合基因在毕赤酵母中获得高表达，并对纯化条件进行摸索，同时对纯化后的2Gly-hGLP-1-HSA融合基因的生物学活性进行了鉴定，为今后长效GLP-1的研究与产业化发展奠定基础。 本研究通过人工合成和PCR相结合的方法获得人胰高血糖素样肽-1突变体基因片段2Gly-hGLP-1，同时获得了2Gly-hGLP-1和白蛋白的融合基因2Gly-hGLP-1-HSA(2Gly-hGLP-1的C端与HSA的N端通过甘氨酸五肽(GGGGG)接头作为连接肽)，构建了能在毕赤酵母(Pichia pastoris)中表达的重组表达载体(pPIC9/2GIy-hGLP-1-HSA)，通过电击转化到巴斯德毕赤酵母(GS115)中并进行诱导表达，筛选得到的高表达菌株经5L发酵罐发酵培养，分离纯化后，目的蛋白纯度可达到95％以上，浓度为为1.24g/L。通过动物实验证实了在毕赤酵母中分泌表达的重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA具有控制血糖的生物活性。现将主要研究结果总结如下： 1.通过人工和PCR相结合的方法得到了2Gly-hGLP-1基因，确定了所用的PCR条件为：94℃ 变性5min，65℃退火5 min，72℃延伸10 min，2个循环。一步PCR得到目的基因为90bp。 2.通过已经得到的2Gly-hGLP-1基因和白蛋白基因进行融合，确定了PCR条件为：94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸2min，共进行30个循环，最后72℃延伸10min，获得的融合基因长度为1884bp。 3.得到的2Gly-hGLP-1-HSA基因经过EcoRI+XhoI双酶切，连接到pPIC9载体后在大肠杆菌DH5α进行克隆，并且菌落PCR和测序结果表明目的基因已经连接到载体中。 4.制备了巴斯德毕赤酵母(GS115)感受态细胞，重组表达载体(pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA)通过电击转化剑感受态细胞中，电转化参数为电压2.0KV，电击时间4.5ms，通过MD平板筛选得到工程菌株。 5.确定了工程菌诱导的起始时间和收获时间：工程菌株接种于BMGY培养基中，当菌液OD600=1左右时，添加0.5％的无水甲醇进行诱导，每12h补加0.5％甲醇，经过10％SDS-PAGE电泳检测，结果表明有目的蛋白条带(2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白为69.5kD)，并且在摇瓶条件下，随着诱导时间延长，目的蛋白表达量有累积趋势，并且在诱导84小时内，没有出现目的蛋白降解的情况。 6.在5L发酵罐进行了多批次的发酵培养实验，基本摸清了各项控制参数，获得了稳定高效的表达，5升发酵罐上的表达量超过了100mg/L。 7.初步确定了2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白的纯化工艺：发酵产物离心取上清，依次通过阳离子交换柱SP Sepharose E.F，疏水层析Phenyl Sepharose HP，阴离子交换柱Source 30 Q和分子筛Superdex 75纯化，取各步洗脱液做10％SDS-PAGE电泳分析。结果表明经纯化后样品中的杂蛋白明显减少，目的蛋白纯度可达到95％以上，并用Lowry法测定纯化后2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白的浓度为1.24g/L。 8.对昆明小鼠的糖耐量实验表明，皮下注射3.5mg/Kg纯化后的融合蛋白2Gly-hGLP-1-HSA后20min即可显著地抑制血糖升高的趋势(P＜0.05)，整个过程中血糖的升高程度明显比对照组(皮下注射等体积的生理盐水)缓和，说明2Gly-hGLP-1-HSA融合蛋白具有降血糖活性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第1章文献综述------糖尿病治疗药物胰高血糖素样肽-1研究进展

1.1 GLP-1的特性

1.2 GLP-1R的结构

1.3 GLP-1的生理功能

1.4 GLP-1抑制胰岛β细胞凋亡的信号转导机制

1.5基于GLP-1信号的新型治疗策略

第2章前言

第3章实验材料

3.1材料

3.2主要培养基与溶液

第4章实验方法

4.1目的基因2Gly-hGLP-1-HSA的克隆

4.2 pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA表达载体的构建

4.3表达载体转化工程菌株及目的蛋白的诱导表达

4.4重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA的纯化

4.5重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA的纯度分析

4.6用Lowry法测定纯化后重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA的浓度

4.7重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA生物学活性鉴定

第5章实验结果

5.1目的基因2Gly-hGLP-1-HSA的克隆

5.2表达载体pPIC9/2Gly-hGLP-1-HSA的构建

5.3表达载体转化工程菌株及阳性克隆的诱导表达筛选

5.4重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA的纯化

5.5用Lowry法测定纯化后2Gly-hGLP-1-HSA的浓度

5.6重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA的生物活性测定

第6章讨论

6.1巴斯德毕赤酵母表达系统及对表达产物的降解

6.2白蛋白作为体内延长半衰期的载体蛋白

6.3毕赤酵母偏爱密码子的选择

6.4 GLP-1基因的优化改进

6.5 2Gly-hGLP-1基因的获得

6.6巴斯德毕赤酵母菌的转化方法

6.7巴斯德毕赤酵母工程菌发酵条件的优化

6.8重组蛋白2Gly-hGLP-1-HSA的活性检测

第7章结论

参考文献

附录

致谢