蜡梅凝集素基因Cplectin在百合中的表达及抗虫性初步鉴定

摘要

本文以麝香百合(Lilium longiflorum Tbunb)“素雅”(White-Elegance)和“晶体”(Gelria)作为供试材料，通过外植体的再生，抗生素筛选条件及农杆菌介导遗传转化条件的优化，建立了百合的高频再生及遗传转化体系。用农杆菌介导法将蜡梅凝集素基因Cplectin转入百合中，并对转化植株进行了抗虫实验，主要研究结果如下： 1.高频再生体系的建立 (1)“素雅”鳞茎片的诱导分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L，分化率为91.7％；再生苗鳞茎片的不定芽分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L，分化率为90％；再生苗叶柄的诱导培养基为MS+NAA1mg/L。分化率为77.5％；生根培养基为1/2MS+NAA0.05 mg/L。 (2)“晶体”鳞茎片的诱导分化培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L，分化率为88.3％；愈伤组织的分化培养基为MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L，分化率为250％；胚性保持培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L；再生苗鳞茎片的不定芽分化培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA0.1mg/L，分化率为87.5％；生根培养基为1/2MS+NAA0.05mg/L。 2.遗传转化体系的建立 (1)受体材料选择对于“素雅”这一品种再生苗鳞茎片和小叶柄分化率都比较高，但鳞茎片的组织对农杆菌的耐受能力强，且分化能力强，所以得到的抗性芽率高，而转化受体假阳性率也比较高，会增加后期检测的工作量；而再生苗叶柄的再生能力也比较强。且取材方便，多数直接能分化出幼苗，能够降低变异的发生频率，所以选择“素雅”再生苗叶柄作为受体材料。对于“晶体”这一品种来说，在鳞片再生过程中产生大量的疏松的浅黄色的胚性愈伤组织，多次继代后，仍保持良好的胚性及较强的生命力，接入分化培养基中能顺利分化出再生小植株。这对于遗传转化是非常有利的，所以选择“晶体”胚性愈伤组织作为受体材料。 (2)抗生素浓度的确定根据卡那霉素(Kan)抗性筛选试验，确定了受体材料适宜的筛选浓度，以“素雅”的再．生苗叶柄为受体材料，当卡那霉素的浓度为100mg/L时，叶柄的褐变率为97.5％，为亚致死浓度，所以Kan100mg/L适合作为叶柄的抗性筛选压；同理，以“晶体”的愈伤组织为受体材料时，当卡那霉素浓度为75mg/L时，愈伤组织褐变率为95％，所以Kan75mg/L适合作为愈伤组织的抗性筛选压。在生根培养基中，当Kan浓度为150mg/L时，以上两个品种的再生苗叶全部变黄，没有根生成，所以选用Kan150mg/L作为转化植株生根的筛选浓度。 根据头孢霉素(Cef)抑菌试验，在头孢霉素浓度为250mg/L时，以上受体材料均有很好的抑菌效果，且不影响受体生长，所以选择为250mg/L作为抑菌浓度。 (3)遗传转化条件的研究本试验对影响农杆菌转化效率的几个主要因素进行了研究，结果发现：取“素雅”的再生苗叶柄作为受体材料，预培养2d后，在OD600值为0.6-0.8的农杆菌菌液的MS(无NH4NO3)重悬液中侵染10-12min，再共培养3d，可获得的较高瞬时表达率，为41.6％：“晶体”愈伤组织作为受体时，将经过2-3min创伤处理的愈伤组织，放在OD600值为0.6-0.8的农杆菌菌液的MS重悬液中侵染8-10min。共培养3d，瞬时表达率较高，为43.3％。 在以上研究的基础上，进一步研究发现，两种受体材料，在离心重悬的MS液(无NH4NO3)中加入100μmol/L乙酰丁香酮，在共培养基中也加入100μmol/L乙酰丁香酮时，瞬时表达率较不添加乙酰丁香酮时有大幅度提高。分别从41.6％和43.3％，提高到71.6％和75.0％。 3.转化植株的获得通过筛选培养，获得卡那霉素抗性植株，对“素雅”86株抗性株和“晶体”93株抗性株进行GUS染色和PCR检测，初步鉴定凝集素基因Cplectin已经整合到两种百合中，其中各有21株和25株为阳性。转化率分别为24.4％和26.8％。 4.抗虫性实验将阳性植株移栽后与未转基因植株的进行抗蚜虫试验，实验结果表明：这两个品种的转基因植株在抗虫性上明显高于对照的未转基因植株。

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论文说明：缩略词表

声明

第1章文献综述

1.1农杆菌介导的单子叶植物转基因研究进展

1.2抗虫基因工程育种的现状

1.3百合基因工程研究进展及存在的问题

第2章引言

第3章实验材料与方法

3.1供试材料

3.2试验方法

第4章结果和分析

4.1植株高频再生体系的建立

4.2受体材料的选择

4.3抗生素敏感性试验

4.4百合遗传转化的主要影响因素的研究

4.5基因的表达检测

4.6抗虫实验

第5章结论

5.1建立了麝香百合高频再生体系

5.2建立了麝香百合遗传转化的受体系统

5.3建立了麝香百合的遗传转化体系

5.4获得转化植株及抗性试验

第6章讨论

6.1百合的遗传转化体系

6.2影响百合转化率的因素

6.3展望

参考文献

致谢

发表的文章及参与的项目