肉鸡S.enteritidis感染的诊断及防制初步研究

摘要

肠炎沙门氏菌(S． enteritidis)属于无宿主特异性而有侵害性的病原菌之一，是通过污染动物性产品而引起人类细菌性食物中毒的主要致病菌，其中禽肉及禽蛋的污染最为严重。随着家禽养殖业的集约化程度提高，肠炎沙门氏菌的感染形式发生了明显改变，从隐性感染和消化系统疾患转变为以败血症和纤维素性渗出性炎症为主的全身性感染，其对养禽业造成的经济损失加大，且对人类健康的威胁也逐渐增加。自2007年7月以来，重庆主要肉鸡养殖地区流行一种以纤维素性渗出性炎症为主要特征的疾病，阿莫西林、庆大霉素等常用抗菌药物预防和治疗效果差，已造成较为严重的经济损失。本文利用流行病学、病原学和病理学等方法对该疾病进行诊断，并对防制措施进行了初步研究。 1．流行病学调查 通过兽医门诊和现场调查，对重庆地区肉鸡以纤维素性渗出性炎症为主要特征的疾病进行流行病学调查。175例肉鸡门诊病例中，表现为纤维素性渗出性炎症的病例为49.1％(86/175)，其中0～3周龄的病例占总病例的26.7％(23/86)、3～6周龄为40.7％(35/86)、6周龄以上为32.6％(28/86)；该病多发于冬春季节，其门诊病例数是夏秋季节的1.6倍，现场调查的发病率和死亡率是夏秋季节的1.46倍和2.32倍；饲养水平影响发病率和死亡率，其中低和高饲养水平的发病率分别为37.3％和15.3％、死亡率分别为17.1％和6.6％；在所有调查病例的养殖场均存在抗菌药物长时间及大剂量使用现象。 2．肠炎沙门氏菌的分离鉴定 从2007年7月至2008年6月收集的以纤维素性渗出性炎症为主要病变的病例中，利用SS营养琼脂平板分离纯化出30株细菌，经细菌理化特性鉴定出肠炎沙门氏菌26株。细菌经LB培养后，约4.0×109CFU/0.5ml菌液经皮下注射接种12日龄肉鸡，26株细菌均能引起发病与死亡，死亡动物表现为与临床病例一致的纤维素性心包炎、气囊炎和肝周炎。以细菌基因组DNA为模板，用肠炎沙门氏菌F14基因的特异性引物sefF和sefR进行PCR，均能扩增出与理论大小一致的DNA片段。以扩增细菌16SrRNA基因的通用引物(16S-8F/20)和(16S-1512R/21)进行PCR，从分离的CQ0709株细菌基因组DNA中扩增出约1500bp的DNA片段，经克隆测序为1505bp，与已报道的多株肠炎沙门氏菌16SrRNA基因的部分序列的相似性在99％以上。体外药敏试验结果表明，分离鉴定的26株细菌对阿莫西林、庆大霉素和环丙沙星等常用抗菌药物的耐药性严重且普遍存在多重耐药，但对舒普深、米诺环素、呋喃妥因等临床少用或禁用药物敏感较高。 3．病理组织学变化 自然病例的组织变化主要发生在心、肝、脾、肾等实质脏器。心肌纤维肿胀变粗，横纹不明显，心包膜内有红染丝状纤维素性渗出，形成脓球；肝细胞肿大，胞浆内充满絮状颗粒，肝血窦淤血，肝包膜增厚，内有红色网状纤维素；脾脏中央动脉内皮细胞肿胀，脾小体充血、坏死，周边可见散在分布的坏死灶；肾小球肿大，毛细血管内皮细胞肿胀，囊腔狭窄，小管上皮细胞胞浆着色不均，颗粒变性。 4．灭活疫苗与抗体的免疫保护作用 利用分离鉴定的肠炎沙门氏菌CQ0709株制备油乳剂灭活疫苗。5日龄三黄肉鸡颈部皮下接种0.5ml/羽(含菌量2.0×109CFU)，免疫后15d的血清琼扩抗体效价1：8，用10×LD50的CQ0709株菌液的攻毒保护率为100％(11/11)，而油佐剂对照组的发病率和死亡率分别为100％(11/11)和81.8％(9/11)。油乳剂灭活疫苗免疫产蛋母鸡制备的抗体用于12日龄肉鸡的被动免疫保护，每只试验鸡颈部皮下注射2ml、1ml和0.5ml后24h的攻毒保护率分别为100％(11/11)、100％(11/11)和63.6％(7/11)，而非免蛋黄液对照组动物全部死亡。

目录

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第1章文献综述

1.1肉鸡“渗出性炎症”病因概况

1.1.1大肠杆菌引起肉鸡“渗出性炎症”

1.1.2沙门氏菌引起肉鸡“渗出性炎症”

1.1.3混合感染引起肉鸡“渗出性炎症”

1.2沙门氏菌基本特性

1.2.1沙门氏菌生化特性

1.2.2沙门氏菌抵抗力

1.2.3沙门氏菌抗原结构

1.2.4沙门氏菌毒力因子

1.2.5沙门氏菌流行特征

1.2.6沙门氏菌对公共卫生的危害

1.3沙门氏菌诊断方法研究进展

1.3.1细菌分离鉴定

1.3.2针对抗体检测方法

1.3.3针对核酸的检测

第2章引言

第3章肉鸡S.enteritidis感染的诊断及防制初步研究

3.1试验材料

3.1.1主要药品与试剂

3.1.2主要试验仪器

3.1.3试验动物

3.1.4主要溶液和培养基的制备

3.2试验方法

3.2.1流行病学调查

3.2.2细菌分离与鉴定

3.2.3病理组织学观察

3.2.4疾病防制

3.3结果

3.3.1疾病的流行病学调查

3.3.2细菌分离与理化鉴定

3.3.3动物试验

3.3.4细菌16SrRNA基因部分序列分析

3.3.5细菌sefA基因检测

3.3.6病理组织学观察

3.3.7细菌体外药敏试验

3.3.8细菌血清型

3.3.9灭活疫苗的攻毒保护

3.3.10抗体的被动免疫保护

3.4讨论

3.4.1细菌的分离鉴定

3.4.2 16SrRNA基因部分序列分析在细菌鉴定中的应用

3.4.3肠炎沙门氏菌流行动态变化

3.4.4疫苗与抗体在防制肠炎沙门氏菌感染中的作用

3.4.5肠炎沙门氏菌的耐药性

第4章结论

参考文献

附录：缩略词

致谢

研究生在读期间发表文章情况