诱导人骨髓间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞治疗视网膜变性疾病的实验研究

摘要

研究背景和目的:
　　视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelial，RPE)细胞的变性、坏死和丢失可造成视网膜和脉络膜的损害，导致视网膜变性类疾病的发生和视力下降。目前尚无有效治疗RPE变性的方法。细胞移植是治疗RPE细胞变性的具有前景的方法，但是如何获得数量充足的、低免疫排斥和低成瘤风险的RPE细胞是目前细胞治疗RPE变性的所面临的主要问题。而在可用于视网膜变性疾病治疗的干细胞中，胚胎干细胞（embryonicstemcells，ESCs）因其全能分化特性（可分化为包括RPE在内的体内所有细胞类型）和无限增殖能力，被认为是可用于视网膜变性类疾病治疗的重要种子细胞。然而，ESCs来源的治疗细胞的免疫排斥和成瘤风险、以及不可控增殖、伦医学等问题限制了ESCs的临床转化。和ESCs相比，目前已在临床广泛应用的自体成体干细胞可避免免疫排斥和成瘤风险，且自体取材可规避伦理障碍。在本课题中，我们重点研究是否能将成体干细胞中的间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)诱导分化为RPE样的细胞，并且具备天然RPE细胞的生理功能，并最终转化成为治疗视网膜变性类疾病的理想种子细胞。
　　方法:
　　1、hMSCs和猪RPE细胞的分离
　　(1)原代分离和纯化获得hMSCs和猪RPE细胞，观察细胞形态;
　　(2)hMSCs和猪RPE细胞标记检测、hMSCs成骨诱导分化钙结节茜素红染色、成软骨诱导分化甲苯胺蓝染色和成脂肪诱导分化油红-0染色鉴定hMSCs;免疫荧光鉴定猪RPE细胞。
　　2、hMSCs和猪RPE的共培养及其向RPE细胞的分化
　　(1)Transwell共培养法诱导hMSCs向RPE细胞分化;条件培养基法诱导hMSCs向RPE细胞分化;
　　(2)hMSCs来源RPE细胞的鉴定
　　细胞形态学观察、细胞内色素含量的定量分析、透射电镜检测、Real-timePCR、免疫荧光染色检测、吞噬实验和细胞断层扫描、WesternBlot、验证MERTK蛋白在诱导细胞特异性吞噬功能中的作用和诱导细胞的神经营养因子分泌能力检测。
　　3、hMSCs来源RPE细胞对急、慢性视网膜变性的修复作用
　　(1)碘酸钠注射制备急性视网膜变性大鼠模型及鉴定:HE染色和F-ERG检测;
　　(2)急性视网膜变性大鼠模型视网膜下腔移植分别于移植后4周、8周检测以下指标:细胞形态学观察、免疫荧光染色检测hESCs来源的RPE细胞、吞噬实验和细胞断层扫描、移植后免疫荧光染色检测、F-ERG和WesternBlot。
　　(3)选取21天龄的RCS白化大鼠进行视网膜下腔移植，分别于移植后4周、8周检测以下指标:外核层厚度的测量、移植后细胞的免疫荧光染色检测、F-ERG和WesternBlot检测细胞在体的吞噬能力。
　　结果:
　　1、hMSCs的鉴定
　　(1)hMSCs形态多为梭形成纤维细胞样外观，呈旋涡状排列;猪RPE细胞外形呈多边形，细胞内充满了棕黑色的色素颗粒;
　　(2)hMSCs的表面标志CD73、CD90、CD105表达强阳性，而CD14、CD45、CD34阴性;茜素红染色后，细胞间出现致密的、圆形不透光团块状的红色结节;阿新蓝染色可见细胞外基质被染成蓝色，成条索状错综排列;油红-0染色细胞中含有被染成红色的脂肪颗粒;猪RPE细胞CRALBP、RPE65、ZO-1表达均为阳性。
　　2、hMSCs向RPE细胞的分化
　　(1)hMSCs共培养诱导后的RPE样细胞可观察到hMSCs中出现丰富的色素颗粒，含量接近于成体猪的RPE细胞，而采用条件培养基诱导法获得细胞色素含量较少;
　　(2)共培养hMSCs-RPE细胞的色素含量与RPE细胞相比无统计学差异，条件培养基诱导hMSCs-RPE细胞内色素颗粒含量与共培养hMSCs-RPE细胞的色素含量相比具有统计学差异;
　　(3)透射电镜观察见hMSCs-RPE细胞内可见成熟的色素颗粒，细胞顶端可见典型的微绒毛结构;
　　(4)hMSCs-RPE细胞表达RPE细胞特异的基因MITF、OTX2、tyrosinase、RPE65、Bestrophine、PEDF、PMEL17、CRALBP、PAX6和诱导前相比都显著上调，且和原代分离的人RPE细胞的表达水平相类似;
　　(5)hMSCs-RPE细胞可表达RPE细胞特异的蛋白CRALBP、RPE65和ZO-1;
　　(6)FITC标记的POS和hMSCs-RPE细胞共孵育后，猪RPE细胞和诱导细胞内均可观察到绿色荧光，而未诱导的hMSCs内未见到绿色荧光;hMSCs-RPE细胞MERTK蛋白表达显著上调，αvβ5Integrin的表达也有所上调，MERTK抗体封闭掉该受体的功能后，吞噬POS的能力显著下降;
　　(7)hMSCs-RPE细胞BDNF和GDNF的分泌量上调明显，但仍显著低于猪RPE细胞。
　　3、hMSCs来源RPE细胞对急、慢性视网膜变性的修复作用
　　(1)碘酸钠损伤模型的视网膜HE染色可见后极部RPE细胞几乎完全损毁，部分RPE细胞死亡后残留的色素团块残留于Bruch's膜上，上方的感光细胞层呈波浪形;F-ERG显示A波和B波的幅值较正常大鼠均显著降低;
　　(2)碘酸钠损伤的急性视网膜变性模型中，移植后4周、8周视网膜免疫荧光染色共聚焦扫描可见，hMSC来源的RPE细胞可表达mitochondrial和CRALBP;
　　(3)碘酸钠损伤的急性视网膜变性模型中，移植后4周、8周F-ERG结果显示了hMSCs-RPE细胞移植后较伪手术组和移植未诱导分化的hMSC组，A波和B波的波幅明显升高，具有统计学意义;
　　(4)碘酸钠损伤的急性视网膜变性模型中，移植后4周和8周视网膜总蛋白的WesternBlot结果显示rhodopsin的表达量在移植hMSCs-RPE细胞组较伪手术组和移植hMSC组明显升高，具有统计学意义。
　　(5)RCS慢性视网膜变性模型中，移植后4周和8周hMSCs-RPE细胞组较伪手术组和移植hMSC组大鼠视网膜外核层厚度明显增厚，具有统计学意义;
　　(6)RCS慢性视网膜变性模型中，移植后4周和8周视网膜免疫荧光染色共聚焦扫描可见，hMSC来源的RPE细胞可表达mitochondrial和CRALBP，但在8周时间点移植细胞存活较4周明显减少;
　　(7)RCS慢性视网膜变性模型中，移植后4周F-ERG结果显示hMSCs-RPE细胞组较伪手术组和移植hMSC组，A波和B波的波幅明显升高，，具有统计学意义;而在移植后8周，各组电生理均呈熄灭型，各组间幅值无统计学差异;
　　(8)RCS慢性视网膜变性模型中，移植后4周、8周视网膜总蛋白的WesternBlot结果显示，MERTK蛋白的表达在移植hMSC来源的RPE细胞组4周为阳性8周时呈阴性，伪手术4周、8周均为阴性;
　　(9)RCS慢性视网膜变性模型中，移植后4周和8周视网膜免疫荧光染色共聚焦扫描可见，4周时RPE65阳性的移植细胞内存在rhodopsin阳性的感光细胞外节，而8周时未见RPE65阳性的移植细胞内存在rhodopsin阳性的感光细胞外节。
　　结论:
　　1、成功分离获得了hMSCs和猪RPE细胞，获得细胞的细胞形态和细胞表面标志符合hMSCs和猪RPE细胞的特性;
　　2、通过Transwell构建hMSCs和RPE细胞的体外非接触共培养体系，诱导hMSCs向RPE细胞分化，诱导的RPE细胞的体外生物学特性和功能类似于原代分离的RPE细胞。
　　3、碘酸钠尾静脉注射制造的急性视网膜变性大鼠模型，其视网膜组织和结构改变符合急性视网膜变性的改变;
　　4、碘酸钠损伤的急性视网膜变性大鼠经移植hMSCs-RPE细胞后，对感光细胞具有更好的保护作用、对视功能有更好的维持作用;
　　5、在RCS大鼠慢性视网膜变性模型中，移植hMSCs-RPE细胞后，具有吞噬感光细胞外节的能力;但在移植后8周存活细胞数量显著降低，少量细胞表达成熟RPE细胞的标记，未观察到移植细胞具有吞噬感光细胞外节的能力，对视功能的维持作用消失。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 视网膜色素上皮细胞变性引起视网膜变性类疾病

1．2 移植细胞有限的来源制约了对RPE细胞变性的治疗

1．3 干细胞学为RPE细胞变性的治疗带来希望

1．4 MSCs向RPE细胞分化的诱导方法

第二章 体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的研究

2．1 前言

2．2 人骨髓间充质干细胞和猪视网膜色素上皮细胞的获取和鉴定

2．3 非接触式共培养体外诱导人骨髓间充质干细胞分化为视网膜色素上皮细胞的表型和功能研究

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 人骨髓间充质干细胞来源的视网膜色素上皮细胞治疗视网膜变性的研究

3．1 前言

3．2 人骨髓间充质干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植治疗大鼠急性视网膜变性的实验研究

3．3 人骨髓间充质干细胞来源的视网膜色素上皮细胞移植治疗大鼠慢性视网膜变性的实验研究

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述 干细胞用于视网膜变性疾病治疗的现状、进展和临床转化前景

在读博士学位期间取得的成果

致谢