STBM介导树突状细胞免疫调节与PE发病的研究

摘要

目的:
　　子痫前期(PE)是一种复杂疾病，其病因及发病机制均不明，以孕20周后母体出现高血压、蛋白尿等为主要特征，PE是一种影响全身小动脉的特发性疾病，能够引起产妇和胎儿脑出血、昏迷和早产。而合体滋养细胞微泡(STBM)是母体释放的胎盘源性不良因子之一。人胎盘的合体滋养细胞产生和分泌大小不同、形态和功能各异的胞外囊泡状结构，并且参与妊娠期母胎之间的对话。STBM是合体滋养细胞激活或凋亡时由合体滋养细胞胞膜脱落下来的较大的囊泡(0.2-2um)。STBM脱落的同时，合体滋养细胞会分泌外泌体(exosome)，只是体积更小，直径为纳米级的(30-150nm)。STBM被释放入血后被胎盘绒毛覆盖，并且有对应的生物学功能。STBM在母体免疫系统中的主要作用是促炎性免疫激活，而外泌体则能够通过多种途径降低母体免疫。有研究发现PE患者外周血中的STBM的浓度较正常的孕妇或未孕妇女高，且早发型重度子痫前期尤甚。
　　免疫-炎症反应实际上在孕早期就存在于正常妊娠母体内，但程度轻微且受严密调控，近年研究表明，PE发病的中心环节之一就是母胎免疫耐受失衡。妊娠是一种成功的半同种移植现象，既往研究表明正常妊娠时母体免疫状态以Th2-Treg型免疫耐受为主，即维持母体的免疫耐受状态从而保护胎儿免受母体免疫系统攻击，妊娠得以继续;而PE时母体免疫状态则以Th1-Th17型免疫激活为主，使全身系统性炎症反应急剧扩大，最终引发多器官功能病变。
　　树突状细胞(Dendreitic cells，DCs)是体内功能最为强大的专职抗原递呈细胞，在诱导免疫耐受中发挥重要作用，但树突状细胞在妊娠免疫调节中扮演什么角色目前尚未完全阐明。有研究表明DCs具有诱导免疫耐受和免疫激活的双面性，而其成熟状态决定免疫应答的结局。成熟的DCs表达与抗原递呈相关的组织相容性复合物(MCHⅡ)类分子、表面共刺激分子CD80、CD86等，可以诱导T细胞产生细胞免疫反应，从而使机体向Th1-Th17型免疫方向转移，诱导母体系统性炎症反应;而未成熟DC（immature DCs，iDCs），将抗原递呈给CD4+T细胞后不能将其激活，诱导机体向Th2-Treg方向转移，介导胎儿抗原特异性免疫耐受状态。有研究表明STBM具有激活粒细胞、诱导细胞免疫，调节促炎性细胞因子释放的功能。同时STBM也可诱导单核细胞，引起TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等细胞因子释放增强，从而调节Th1-Th17/Th2-Treg免疫失衡。而DCs与粒细胞和单核细胞具有相同的前体细胞，鉴于STBM与DCs的密切关系，我们试图通过观察胎盘合体滋养细胞微泡对树突状细胞分化状态的影响，初步探讨STBM对树突状细胞表型分化、合成分泌及抗原提呈等生物学功能的调节作用，进一步明确了STBM、DCs与子痫前期发生系统性炎症反应的关系。为重建PE患者免疫监视以维持母体免疫状态提供初步的实验依据，为干预、阻断孕晚期免疫失衡所致的全身系统性炎症反应这一病理过程奠定基础。
　　方法:
　　第一部分:子痫前期患者胎盘组织中树突状细胞的分子表达及分布特点
　　1.严格按照纳入标准和排除标准选取第三军医大学第三附属医院（大坪医院）产科2014年01月-2015年9月间收治的子痫前期患者（PE组）17例和正常晚孕患者（control组）20例，均取择期剖宫产术后的胎盘组织。
　　2.HE染色观察正常妊娠胎盘组织与子痫前期患者胎盘组织的绒毛和血管的差异;
　　3.免疫组化方法检测正常妊娠胎盘组织与子痫前期患者胎盘组织DCs的分布状态、部位以及数量差异性;
　　结果:
　　1.HE染色可见PE患者胎盘组织中血管腔较正常晚孕对照组的小，且血管闭塞，绒毛血液明显灌注不足。
　　2.免疫组化结果可见子痫前期患者胎盘组织中CD1a+DCs的数量较正常晚孕期组少(P＜0.05)。
　　3.免疫组化结果可见子痫前期患者胎盘组织中CD83+DCs的数量较正常晚孕期组多（P＜0.05）。多(P＜0.05)。
　　第二部分:小鼠合体滋养细胞微泡(STBM)对树突状细胞(DCs)分化及免疫功能的影响
　　方法:
　　1.机械法和差速离心法制备小鼠合体滋养细胞微泡(STBM):8周龄C57BL/6小鼠，于妊娠第18天戊巴比妥麻醉后，无菌条件下剪开小鼠串珠样子宫取出胎盘，放入消毒后的冰磷酸盐缓冲液(PBS)中反复冲洗，直至PBS中无残留血液和蜕膜，无菌纱布吸干水分后称重，无菌眼科剪将胎盘剪碎（约1mm3），按2.5g/100mL的比例加入NaCl溶液（1％青-链霉素），4℃振荡过夜，次日取上清离心:1500g，10min，取上清;10000g，60min，取上清;100000g，60min，取沉淀;4℃的PBS（含5％蔗糖）重悬。
　　2.制备小鼠树突状细胞(DCs):无菌条件下取6周龄雌性C57BL/6小鼠的股骨、胫骨，用红细胞裂解液裂解红细胞后，应用重组鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（Recombinant mouse gramulocyre-macrophage，rmGM-CSF）和重组鼠白介素4（Recombinant mouse Interleukin-4，rmIL-4）进行体外诱导培养DCs，DCs分组如下:A组:阴性对照组:DCs+PBS;B组:DCs+STBM(1.0μg/mL);C组:DCs+STBM(1.5μg/mL);D组:DCs+STBM(2.0μg/mL);E组:DCs+STBM(2.5μg/mL);F组:DCs+LPS(2.0μg/mL)。
　　3.透射电子显微镜观察鉴定STBM。将STBM稀释40倍，滴液法制片，待样品干燥后上机观察。
　　4.免疫荧光方法鉴定检测小鼠树突状细胞。
　　5.通过流式细胞学技术(Flow CytoMetry，FCM)检测各组DCs表达CD11c和CD86的变化。
　　6.应用蛋白印迹法(Western Blot)检测各组DCs表达CD80和CD86的变化。
　　7.应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA法）检测DCs分泌TNF-α、IFN-γ、IL-12的水平。
　　结果:
　　小鼠合体滋养细胞微泡(STBM)对树突状细胞表型及免疫功能的影响
　　1.STBM的形态学观察:扫描电子显微镜下可见STBM为双层膜囊泡状结构，Image-Pro Plus6.0软件测得STBM囊泡状的直径为0.647μm-1.438μm，平均值为(1.025±0.236)μm。
　　2.免疫荧光可见培养至第5天簇集成团落状的树突状细胞。
　　3.STBM刺激DCs后其表型分化:以不同浓度的STBM(1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL)作用于GM-CSF诱导培养小鼠骨髓DCs，流式细胞学技术检测不同处理组细胞表面分子CD11c的表达水平无明显差异性（P＞0.05）;而各组细胞CD86表达水平随STBM浓度的升高而增加。浓度分别为1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL、2.5μg/mL的STBM，其CD11c/CD86双阳性表达率分别为46.1±3.5％，56.9±2.8％，60.5±3.2％，88.9±3.0％，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4.Western Blot法检测不同浓度STBM刺激DCs后，DCs表达CD80、CD86蛋白量随着STBM浓度的增高而逐渐增多，CD80、CD86是小鼠成熟DCs的特异性分子，其蛋白量表达越多，表明成熟DCs的数量越多。由图可看出，STBM1.5μg/mL、STBM2.0μg/mL、STBM2.5μg/mL组与PBS（control组）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　5.分泌TNF-α的水平:不同浓度的STBM(STBM1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)刺激DCs，其诱导DCs产生的TNF-α的浓度分别为(6.91±1.37)pg/mL、(7.98±1.55)pg/mL、(9.40±0.93)pg/mL、(12.65±1.62)pg/mL，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　分泌IFN-γ的水平:不同浓度的STBM(STBM2.0μg/mL、4.0μg/mL)刺激DCs，其诱导DCs产生的IFN-γ的浓度分别为(12.14±1.39)pg/mL、(17.52±1.67)pg/mL，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　分泌IL-12的水平:不同浓度的STBM(STBM2.0μg/mL、4.0μg/mL、6.0μg/mL)刺激DCs，其诱导DCs产生IL-12的浓度分别为(6.98±1.19)ng/L、(7.88±0.10)ng/L、(9.18±1.69) ng/L，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.子痫前期患者胎盘组织中的成熟树突状细胞的数量较正常妊娠组显著增多。提示成熟树突状细胞数量的增加可能与子痫前期发病有关。
　　2.STBM可促进DCs的成熟，增强DCs的免疫活性，同时上调TNF-α、IFN-γ和IL-12等促炎性细胞因子的水平，从而使母体系统性炎症反应增强，可能是子痫前期树突状细胞增多的一个原因。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 子痫前期患者胎盘组织中树突状细胞的表达及分布特点

2．1 材料与方法

2．2 实验结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 小鼠合体滋养细胞微泡对树突状细胞表型及免疫功能的影响

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述一 初始免疫系统在子痫前期中的作用

文献综述二 细胞因子在子痫前期中的关键作用

硕士期间发表的论文

致谢