转录因子Nrf2对大鼠心肌微血管内皮细胞在血管生成中作用的影响及其机制的体外研究

摘要

研究背景：
　　冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronaryatheroscleroticheartdisease，CAD)是当今世界严重危害人类健康的常见心脏病之一，是主要的致残和致死性疾病。如何有效地预防及治疗冠心病已成为目前心血管疾病研究的重要领域。尽管药物治疗、经皮冠状动脉介入(percutaneouscoronaryinterventions，PCI)治疗和冠状动脉旁路移植术（coronaryarterybypassgrafting，CABG）发展迅速，仍有10％～37％的冠心病患者因冠状动脉病变特殊性及其解剖因素的限制，不适合任何一种冠脉干预措施，或者仅接受了不完全的血运重建治疗，发生严重心肌缺血，心功能随之减退，导致此类患者致残和致死率极高。治疗性血管生成即通过基因、蛋白和细胞水平的技术诱导新生血管形成、侧枝血管的生长，形成有血供的侧枝循环。目前，治疗性血管生成已成为那些不能经常规血运重建措施（例如PCI或CABG）达到血运重建或完全血运重建的严重/晚期冠心病患者可供选择的治疗方式之一，治疗性血管生成可通过增加缺血心肌的血供改善冠心病患者的症状、心脏功能和预后。众所周知，心肌微血管内皮细胞(cardiacmicro-vascularendothelialcells，CMECs)是来源于冠状循环微血管的一种特殊细胞类型，在血管生成过程中发挥着关键作用。
　　核因子转录因子2(NF-E2p45-relatedFactor2，Nrf2)是一种亮氨酸拉链结构(basicleucinezipper,bZip)转录因子，在机体抗氧化应激中发挥重要作用，其激活可导致下游多种抗氧化基因的表达，如血红素加氧酶-1(Hemeoxygenase-1，HO-1)等。目前，已有国外研究证实Nrf2可促进深层毛细血管数量的增加及促进血管内皮细胞的出芽生长，在心血管保护方面亦有研究，如抑制心肌肥厚、保护心肌细胞避免缺血再灌注损伤及延缓动脉粥样硬化发生等。但Nrf2在冠心病梗死/缺血心肌血管生成中的作用及具体机制仍不甚清楚。同时，在缺血/梗死心肌区域，Nrf2的自身激活是有限的。而血管生成效应呈时间依赖现象，对促血管生成基因表达的高低也有相应要求。因此，各种促进心肌Nrf2高表达的干预因素，可通过增加治疗性血管生成最终促进心肌修复。
　　本课题以CMECs为研究对象，采用Nrf2基因转染的方法，探讨Nrf2是否促进细胞体外血管生成，并进一步阐明Nrf2是否通过调节HO-1的表达来实现其促血管生成作用。
　　研究方法：
　　第一部分 大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)的分离、培养及鉴定与低氧和常氧条件下Nrf2及HO-1转录和蛋白水平表达的变化。
　　取健康成年SD雄性大鼠，经手术取其心脏，采用组织贴块法培养CMECs，第2代细胞行Ⅷ因子免疫组织化学鉴定为CMECs，实验采用第3-4代细胞。将CMECs分为正常对照组和短时间缺氧组:①缺氧(1h)组，②缺氧(2h)组，③缺氧(4h)组，④缺氧(12h)组，⑤缺氧(24h)组;经缺氧孵箱培养不同时间后取出，以real-timeRT-PCR及Westernblot法检测细胞中Nrf2mRNA及蛋白表达变化。同时，将CMECs分为正常对照组和长时间缺氧组:①缺氧(12h)组，②缺氧(24h)组，③缺氧(48h)组，④缺氧(72h)组;缺氧孵箱培养不同时间后取出，以real-timeRT-PCR及Westernblot法分别检测细胞中Nrf2及HO-1mRNA及蛋白表达变化。上述实验确定缺氧能否激活Nrf2及导致HO-1水平的相应变化。
　　第二部分 转录因子Nrf2对缺氧条件下CMECs迁移及成血管能力的影响及下游靶基因HO-1的调控。
　　将购买的Nrf2短发夹RNA慢病毒(Nrf2shRNALentiviralParticles，shRNA-Nrf2)及空载短发夹RNA慢病毒（controlshRNALentiviralParticles-A，shRNA-control）分别转染CMECs，以RT-PCR及Westernblot法检测Nrf2的mRNA及蛋白表达，确定干扰是否成功。将CMECs分为:①单纯CMECs对照组，②shRNA-control转染CMECs组，③shRNA-Nrf2转染CMECs组。采用Transwell小室法及Matrigelassay法分别检测细胞迁移能力及成血管能力。以RT-PCR法检测HO-1及血管内皮生长因子(Vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)mRNA水平变化，以Westernblot法及ELISA法分别检测细胞中HO-1及VEGF的蛋白表达变化。
　　第三部分 转录因子Nrf2促缺氧条件下CMECs迁移及成血管能力的作用及其机制研究
　　构建Nrf2高表达的慢病毒及空载体，分别转染CMECs，以real-timeRT-PCR及Westernblot法检测Nrf2的mRNA及蛋白表达，确定过表达是否成功。将CMECs分为:①单纯CMECs对照组，②空载慢病毒转染CMECs组，③Nrf2高表达慢病毒转染CMECs组。采用real-timeRT-PCR及Westernblot法检测HO-1的mRNA及蛋白表达变化。
　　然后采用HO-1的活性抑制剂锌原卟啉(Zincprotoporphyrin，Znpp)进一步检测及证实HO-1在Nrf2缺氧条件下促细胞迁移及成血管能力这一机制。将CMECs分为:①单纯CMECs对照组，②空载慢病毒转染CMECs组，③Nrf2高表达慢病毒转染CMECs组，④Nrf2高表达慢病毒转染CMECs+Znpp组。分别采用Transwell小室法及Matrigelassay法检测细胞迁移能力及成血管能力的变化。
　　研究结果：
　　(1)组织贴块法培养的典型原代CMECs呈“铺路石”样形态，细胞采用免疫组织化学法予以鉴定，95％左右的细胞显示Ⅷ因子阳性反应。
　　(2)CMECs短时间缺氧（1、2、4、12及24h）状态下，与正常氧浓度状态下比较，Nrf2mRNA表达（由0.99±0.01上升至2.29±0.06）及蛋白表达（由0.28±0.03上升至0.42±0.02）水平于4小时开始显著上调(P＜0.01)，在24小时内呈时间依赖性递增现象。CMECs在长时间缺氧（12、24、48及72h）条件下，与正常氧浓度比较，Nrf2mRNA及蛋白表达水平暂时性上调，至缺氧48小时表达最强(mRNA表达:0h为0.98±0.02，48h达5.55±0.05;蛋白表达:0h为0.27±0.02，48h达1.20±0.08。P＜0.01)，随之其表达则开始下降。HO-1mRNA及蛋白表达的变化与Nrf2一致。
　　(3)CMECs瞬时转染shRNA-control和shRNA-Nrf2后，与shRNA-control组比较，干扰Nrf2显著降低了Nrf2mRNA及细胞核蛋白的表达水平(mRNA表达:由0.64±0.08降低至0.23±0.04，蛋白表达:由0.73±0.02降低至0.36±0.01，P＜0.01)，同时显著抑制了缺氧12hCMECs迁移及成血管能力，细胞迁移数目及脉管形成长度分别由61.4±2.9和(5.50±0.10)mm减少至38.8±3.7和(2.87±0.21)mm，(P＜0.01)。
　　(4)与shRNA-control组比较，干扰Nrf2显著下调了缺氧12hCMECs中HO-1的mRNA及蛋白表达水平，分别由0.61±0.03和0.70±0.04降低至0.21±0.04和0.47±0.07，(P＜0.01)。VEGFmRNA及蛋白表达水平亦显著下降(P＜0.01)。
　　(5)当MOI=20时，慢病毒对CMECs的转染效率可达91.9±1.3％(n=5)，CMECs的活性及形态不受明显影响。CMECs瞬时转染Len-control和Len-Nrf2后，与Len-control组比较，Len-Nrf2组过表达Nrf2后显著增加Nrf2mRNA及细胞核蛋白表达水平(mRNA表达:由0.96±0.01上升至4.40±0.05，蛋白表达:由0.33±0.03上升至0.77±0.03，P＜0.01)。
　　(6)Nrf2过表达显著增加了缺氧12hCMECs中HO-1mRNA及蛋白表达水平，HO-1mRNA表达由0.95±0.01上升至4.50±0.08(P＜0.01)，HO-1蛋白表达则由0.42±0.02上升至1.03±0.03(P＜0.01)。同时显著增强了缺氧12h的CMECs迁移（细胞迁移数目:80.0±3.8）及成血管能力（脉管形成长度:（62.8±3.5）mm，P＜0.01）。与转染Len-Nrf2组比较，ZnPP（HO-1活性抑制剂）显著抑制了Nrf2过表达后增加的细胞迁移及成血管能力（细胞迁移数目由80.0±3.8减少至55.4±4.0，脉管形成长度由(62.8±3.5)mm缩短为（49.6±2.7)mm,P＜0.01）。
　　结论：
　　(1)缺氧暂时上调了大鼠CMECs中Nrf2mRNA及蛋白表达的水平，伴HO-1mRNA及蛋白表达水平的相应增加。
　　(2)转染shRNA-Nrf2至CMECs，干扰Nrf2后，显著抑制了缺氧条件下CMECs迁移及成血管能力。提示Nrf2在CMECs血管生成中发挥重要作用。
　　(3)Nrf2干扰显著下调了缺氧条件下CMECs中HO-1及促血管生成源性因子VEGFmRNA及蛋白表达的水平。
　　(4)Nrf2过表达显著增强了缺氧条件下CMECs迁移及成血管能力。
　　(5)HO-1涉及Nrf2过表达促缺氧条件下CMECs迁移及成血管能力过程。
　　(6)转录因子Nrf2可能通过上调HO-1表达来介导缺氧条件下CMECs迁移及成血管能力。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 大鼠心肌微血管内皮细胞(CMECs)的分离、培养及鉴定与低氧和常氧条件下CMECs Nrf2及HO-1转录和蛋白水平表达的变化

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 转录因子Nrf2对缺氧条件下CMECs细胞迁移和脉管形成能力的影响及下游靶基因HO-1的调控

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 转录因子Nrf2促缺氧条件下CMECs细胞迁移和脉管形成及其相关机制研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述一 核转录因子Nrf2与心血管保护的研究进展

文献综述二 心肌治疗性血管生成的研究进展

攻读博士学位期间以第一作者发表的文章

致谢