LL37活化浆细胞样树突状细胞在ANCA相关性血管炎中的作用及机制研究

摘要

研究背景：
　　抗中性粒细胞胞浆抗体(anti-neutrophilcytoplasmicantibodies，ANCA)相关性血管炎(ANCAassociatedvasculitis，AAV)是一种自身免疫性小血管炎。约80％累及肾脏，可导致迅速进展、不可逆的肾功能衰竭，预后凶险。迫切要求更加深入地研究AAV的发病机理，以便提出更有效的治疗策略。
　　机体对“自我”和“非我”的识别是免疫反应的基础，决定机体走向免疫耐受或激活。在这一识别中，免疫细胞起关键作用。浆细胞样树突状细胞(plasmacytoiddendriticcells，pDC)属于树突状细胞(dendriticcells，DC)亚型，因其在病原体或其他炎性因素刺激下能够产生大量Ⅰ型干扰素(interferontypeⅠ，IFN-α/β)，而又被称为干扰素产生细胞。在天然免疫中，机体通过病原体相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)及模式识别受体(patternrecognitionreceptors，PPRs)区分“自我”和“非我”。近年来，pDC细胞因其特异性高表达PPRsToll样受体7(Toll-likereceptor7，TLR7)和TLR9，而在自身免疫性疾病中的作用机制受到重视。尤其在银屑病的发生中取得突破性研究进展:发现pDC细胞可通过特异性表达的TLR7和TLR9，经接头分子髓样分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)活化干扰素调节因子-7(interferonregulatoryfactor-7，IRF-7)介导的信号途径，从而产生大量IFN-α，激活NK细胞和髓样树突状细胞等天然免疫细胞，进而活化自身免疫性Th1和Th17细胞，启动获得性免疫应答。
　　在正常情况下，pDC细胞对病原体DNA进行识别引起免疫应答，而对机体自身老化死亡细胞免疫忽视。这种对自身细胞的免疫耐受对维持生物体的完整性及内环境的稳定极其重要。然而，在自身免疫性疾病中，内源性IFN-α诱导物可替代病原体的DNA及RNA，打破免疫耐受，持续刺激pDC产生IFN-α，启动自身免疫应答。研究发现，活动期AAV患者血清IFN-α表达水平明显增高，提示pDC活化导致IFN-α异常高表达参与了自身免疫性疾病的发病机制。结合在银屑病中抗菌肽LL37是导致pDC细胞异常活化的直接因素的研究证明，我们推测:AAV患者体内高表达的IFN-α可能与LL37有关。
　　抗微生物肽是机体天然免疫的重要组成部分。LL-37作为目前人体内发现的唯一一种Cathelicidin类抗微生物肽，已被证实可直接介导pDC细胞识别自身DNA，而参与自身免疫炎症反应。
　　中性粒细胞胞外捕网(neutrophilextracellulartraps，NETs)是中性粒细胞不同于凋亡、坏死的一种新的独特的死亡方式，通过释放大量自身DNA，导致机体自身DNA释放，其过程命名为NETosis。NETs成分含有LL37，且肾组织有pDC细胞表达，根据LL37是介导银屑病pDC细胞识别自身DNA的作用推测:ANCA诱导中性粒细胞活化导致大量NETs产生，可能导致机体对自身DNA的异常识别，打破自身免疫耐受，从而参与ANCA相关小血管炎(AVV)的发病机制。LL37活化pDC细胞极可能在其中起关键作用。
　　本课题拟通过(1)检测AAV患者血清及肾组织抗菌肽LL37及pDC细胞活化产物IFN-α的表达水平，结合临床病例分析LL37及IFN-α表达与临床血清学指标及肾组织损伤程度的关系，以探讨LL37在AAV发病机制中的作用。(2)观察体外分离纯化的AAV患者外周血中性粒细胞NETs发生及LL37的表达，探讨AAV患者体内LL37是否通过NETs发生而释放。(3)体外分离纯化健康人外周血pDC细胞，观察与AAV患者NETs共培养及分别予anti-LL37抗体或TLR9特异性拮抗剂ODN-TTAGG干预后pDC细胞活化、成熟标志的表达及IFN-α的产生，明确AAV患者NETs是否通过LL37活化pDC细胞，探讨LL37诱导pDC细胞识别自身DNA的途径及机制。综合分析上述临床病例、体外细胞实验研究结果，探讨抗微生物肽LL37活化pDC细胞在ANCA相关小血管炎中的机制，明确pDC细胞在整个发病过程中的作用，为进一步探索通过阻断pDC细胞对自身DNA的免疫应答途径治疗AVV的新策略奠定基础。
　　实验方法：
　　第一部分AAV患者血清及肾组织LL37及IFN-α的表达及意义
　　1.收集AAV患者及健康志愿者外周静脉血血清标本，采用ELISA检测血清LL37及IFN-α水平，了解AAV患者体内LL37及IFN-α水平与健康人群的差异。
　　2.回顾性分析AAV患者临床病历资料，采用2×2列联表分析、相关分析、独立样本K-S检验、两独立样本非参数检验曼-惠特尼U检验，评价LL37及IFN-α表达与肾功能损害及肾组织新月体形成的关系。
　　3.收集AAV患者肾组织活检病理标本，通过免疫荧光染色及激光共聚焦方法检测肾组织LL37、IFN-α及pDC细胞特异性表面标志血树突状细胞抗原(blooddendriticcellantigen2，BDCA2)的表达，了解局部肾脏炎症部位是否存在LL37及IFN-α的表达及pDC细胞的募集。
　　第二部分AAV患者NETs的产生及LL37释放
　　1.收集AAV患者及健康志愿者新鲜外周静脉血标本，采用PolymorphprepTM密度梯度离心法分离中性粒细胞并进行体外培养。
　　2.采用免疫荧光染色及激光共聚焦、扫描电镜观察AAV患者及健康志愿者外周血中性粒细胞NETs的产生。
　　3.免疫荧光观察AAV患者及健康志愿者外周血中性粒细胞NETs的产生情况及是否存在LL37的释放。
　　4.ELISA检测中性粒细胞培养上清液中LL37的水平。
　　5.免疫荧光检测AAV患者肾组织NETs组分如组蛋白、自身抗原溶酶体膜蛋白-2(lysosomalmembraneprotein-2，LAMP-2)、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、蛋白水解酶3(protease3，PR3)，的表达，了解肾脏炎症损伤局部募集的中性粒细胞是否存在NETs组分。
　　第三部分AAV患者LL37活化pDC细胞机制
　　1.收集AAV患者及健康志愿者新鲜外周静脉血标本，采用PolymorphprepTM密度梯度离心法分离中性粒细胞，收集体外培养的中性粒细胞上清液。
　　2.采用免疫磁珠技术分选健康人外周血pDC细胞，并通过流式活细胞分选技术进一步提纯，得到CD4+CD11c-Lineage-pDC细胞。
　　3.AAV患者或健康志愿者中性粒细胞NETs上清液与pDC细胞共培养，流式分析检测pDC细胞的活化、成熟标志，观察AAV患者NETs是否可促进pDC细胞的活化、成熟。
　　4.分别予anti-LL37抗体或TLR9特异性拮抗剂ODN-TTAGG干预后，流式分析检测与AAV患者及健康志愿者NETs上清液共培养的pDC细胞的活化、成熟标志。探讨AAV患者NETs是否通过LL37活化pDC细胞，以及LL37活化pDC细胞是否通过TLR9途径实现。
　　5.收集与NETs共培养的各组pDC细胞上清液，ELISA检测IFN-α的表达，明确AAV患者NETs是否通过促进pDC细胞产生IFN-α而参与免疫应答。
　　结果：
　　第一部分
　　1.AAV患者血清LL37及IFN-α水平较健康志愿者明显升高(LL37:U=829.00，P＜0.001;IFN-α:U=1438.00，P＜0.001)，合并新月体肾炎的AAV患者血清LL37及IFN-α水平较无新月体肾炎AAV患者明显增高(LL37:P＜0.01;IFN-α:P＜0.001)。
　　2.高表达LL37及IFN-α的AAV患者较低表达患者合并新月体肾炎的比例更高(LL37:x2=9.724，P=0.002;IFN-α:x2=16.835，P=0.000)。
　　3.AAV患者血清LL37与IFN-α表达水平成正相关限=0.577，P=0.000);且LL37及IFN-α表达水平均与AAV患者血肌酐水平成正相关(LL37:R=0.437，P=0.000;IFN-α:(R=0.337，P=0.004))，与补体C3水平无明显相关性(LL37:R=0.020，P=0.871;IFN-α:R=-0.12,P=0.922)。
　　4.新月体阳性AAV患者肾脏局部炎症组织有LL37及IFN-α高表达，而新月体阴性AAV患者肾组织仅有少量LL37及IFN-α表达。
　　第二部分
　　1.AAV患者外周血中性粒细胞有大量NETs形成，较健康对照组明显增多(P＜0.001)。
　　2.AAV患者外周血中性粒细胞NETs形成释放抗菌肽LL37及ANCA靶抗原LAMP-2、MPO、PR3。
　　3.合并新月体肾炎的AAV患者肾组织炎症损伤局部有NETs形成，并有抗菌肽LL37与ANCA靶抗原LAMP-2、MPO、PR3表达。
　　4.合并新月体肾炎的AAV患者肾组织炎症损伤局部抗菌肽LL37与NETs其他组分如组蛋白、MPO共表达。
　　第三部分
　　1.与AAV患者外周血中性粒细胞NETs上清液共培养的健康人外周血pDC细胞表面活化标志CD80及成熟标志CD83的表达较健康志愿者中性粒细胞组明显增高(CD80:P＜0.01;CD83:P＜0.01)。
　　2.Anti-LL37抗体干预后，与AAV患者NETs上清液共培养的pDC细胞表面标志CD80及CD83表达较干预前明显下降(CD80:P＜0.05;CD83:P＜0.01)。
　　3.ODN-TTAGG干预后，与AAV患者NETs上清液共培养的pDC细胞表面标志CD80及CD83表达较干预前明显下降。(CD80:P＜0.01;CD83:P＜0.01)
　　4.与AAV患者外周血中性粒细胞NETs上清液共培养的健康人外周血pDC细胞上清液IFN-α表达较健康志愿者中性粒细胞组明显增高(P＜0.001)。
　　5.予Anti-LL37抗体或ODN-TTAGG干预后，与AAV患者NETs上清液共培养的pDC细胞上清液IFN-α表达较干预前明显下降(Anti-LL37:P＜0.001;ODN-TTAGG:P＜0.001)。
　　结论：
　　1.AAV患者尤其是合并新月体肾炎的患者，血清LL37及IFN-α水平明显升高。新月体肾炎患者肾脏局部炎症组织有LL37及IFN-α表达。
　　2.AAV患者血清LL37与IFN-α水平成正相关，LL37及IFN-α水平与AAV患者血肌酐水平成正相关，且高表达LL37与IFN-α的AAV患者更易合并新月体肾炎。
　　3.AAV患者外周血中性粒细胞有大量NETs形成。
　　4.AAV患者外周血中性粒细胞NETs形成可释放抗菌肽LL37及ANCA靶抗原LAMP-2、MPO、PR3。
　　5.AAV患者外周血中性粒细胞产生的NETs可刺激体外分离的健康人外周血pDC细胞活化、成熟并产生IFN-α。
　　6.拮抗LL37或TLR9功能后，AAV患者NETs刺激pDC细胞活化、成熟及IFN-α产生能力明显下降。
　　综上所述:AAV患者体内外周血及募集至受累肾脏局部炎症损伤组织的中性粒细胞NETs形成增加，释放大量LL37与自身DNA形成LL37-DNA复合物，通过TLR9途径活化pDC细胞，产生大量IFN-α，参与AAV患者肾脏局部及全身炎症反应及免疫应答。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 ANCA相关性血管炎患者血清及肾组织LL37及IFN-α的表达及意义

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 ANCA相关性血管炎患者NETs的产生及LL37释放

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 ANCA相关性血管炎患者LL37活化pDC细胞的机制

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 结论

全文总结

参考文献

文献综述一 浆细胞样树突状细胞与自身免疫性疾病

文献综述二 树突状细胞老化与自身免疫性疾病的研究进展

附件1 85例AAV患者临床指标

攻读博士期间发表文章

致谢