THAP11作为多聚谷氨酰胺疾病候选致病基因及候选抑癌基因的功能研究

摘要

背景：多聚谷氨酰胺(polyglutamin，po]yQ)疾病是一类神经退行性疾病，该疾病是由于基因编码区域存在的CAG三碱基出现多余重复，导致翻译产物中谷氨酰胺重复数增加而引发，目前尚有大量的致病基因未被揭示，FHAPll中含有一段由CAG编码的谷氨酰胺串联重复排列片段，那么其是否为polyQs疾病的候选致病基因呢?为此，尚需通过对正常人群和神经退行性病变患者的THAPll基因中CAG重复数进行筛查，并对可能在患者中筛查到的含异常扩增CAG的THAPll基因进行功能研究以进一步证实其为polyQ疾病的候选致病基因。另一方面，因THAP蛋白家族的其他成员是一类参与转录抑制，细胞凋亡及增殖抑制过程的蛋白，而且有的已被明确作为抑癌因子，那么THAPll是否也有可能为抑癌因子呢?为此，也尚需对其功能进行研究以验证此假设。 目的： 1)通过检查中国汉族正常人群THAPll基因的CAG重复数目，以获悉其正常变动范围，了解中国汉族人群中神经退行性病变患者THAPll基因的CAG重复序列是否超过此正常变动范围，探寻其作为多聚谷氨酰胺疾病致病基因的可能性。 2)通过对CAG重复数超过正常范围的THAPll基因进行功能研究，进一步验证其作为多聚谷氨酰胺疾病致病基因的可能性。 3)通过对THAFll儿基因的功能研究，探寻其作为抑癌基因的可能性。 方法：1)提取血液组织基因组DNA，PCR扩增，测序等，对中国汉族正常人群及神经退行性病变的患者的THAPll基因中CAG重复序列数进行调查，了解其基因型和分布等特征，明确患者该基因中CAG重复数是否超过正常范围。 2)将含异常扩增CAG的THAPll构建于pEGFP-N1绿色荧光表达载体及蜕皮激素诱导系统的pIND载体中，通过荧光显微镜观察其细胞定位情况及有无蛋白聚合体这一特征性病变形成。 3)通过流式细胞仪检测含异常扩增CAG的‘THAPll对细胞周期有无影响，并进一步通过Western blot检测其对细胞周期蛋白的影响。4)通过采用染色质-结构检测技术，观察TlIAPll对染色质形态的影响，以提示对转录等方面的影响。采用逆转录PCR对肝脏癌及癌旁组织的THAPllmRNA表达水平进行检测，比较二者差异，并进一步采用Real time-PCR在肝癌细胞中检测THAPll对原癌基因c-myc的mRNA表达水平的影响，同时还利用Westernblot从蛋白水平进行验证，揭示其与癌症发生的关系。 结果： 1)通过对中国汉族正常人群中THAPll基因的CAG重复序列进行调查，我们发现其基因中CAG重复存在明显的多态性，不仅表现在CAG重复数目上，还表现在CAG重复中存在着不同位置和数目的CAA的插入。其中，正常汉族人群CAG/CAA的重复数目从22个至34个不等，在该区间中，最常见的重复数为29，占总染色体数的69.6％，其中最常见基因型为(CAG)3CAA(CAG)5CAA(CAG)2CAA(CAG)5CAA(CAG)10，占总染色体数的62.35％；其次最常见CAG/CAA的重复数为28，占总染色体数的14.5％。三核苷酸CAA在CAG中的插入数为2.6个不等，其中2个CAA的插入发生在23个和25个的CAG重复中，6个CAA的插入发生在29个CAG的重复中，最常见CAA插入数的是4个，未被其插入打断的连续CAG最长重复数为15个。 2)通过对神经退行性病变的患者T14APll基因中CAG重复数的筛查，我们发现与正常对照相比患者TltAPll基因中存在不同程度的CAG重复扩增，不但发现了CAG重复数为35的突变THAPll(该类基因型分别存在2个患者异源染色体中，占1.66％)，而且还检测到了CAG重复数为38的突变THAPll(存在于1个患者异源染色体中，占0.83％)，具体基因型为(CAG)3CAA(CAG)sCAA(CAG)2CAA(CAG)sCAA(CAG)aCAA(CAG)10。 3)通过对含异常扩增CAG的THAP11的细胞内荧光定位观察，我们发现THAPll(35Q)的蛋白与正常对照THAPll(290)相比，存在明显的核内蛋白表达增强。而THAPll(38Q)不但具有核内蛋白表达增强，而且还出现了蛋白聚合体沉淀。通过蜕皮激素可诱导表达系统，我们检测出THAPll(38Q)蛋白最初为全细胞分布，随着表达时间的延长，逐渐向核聚集，并形成蛋白聚合体而沉积。 4)通过检测不同polyQs的THAPll对细胞周期的影响，未发现正常人群的THAPll(29Q)对细胞周期有影响；而THApll(38Q)却可以引起明显的G0/G1期阻滞，该期细胞占90.2496，较正常58.52％明显增高。进一步通过对细胞周期蛋白的检测，我们发现THAPll(29Q)对相关细胞周期蛋白无明显影响，而THAPll(38Q)可使细胞中P21蛋白表达增强，CyclinDl蛋白表达减弱，这两种蛋白表达情况与我们检测到的细胞G0/G1期阻滞一致。 5)通过采用染色质结构检测技术，我们观察到THAPll可使染色质发生浓缩，提示其可能具有转录抑制功能和作为抑癌因子。以此为线索，通过检测THAPll在癌及癌旁正常组织中表达量的变化情况，发现THAPll在癌组织的表达较癌旁正常组织明显下降，从而进一步提示THAPll可能作为抑癌因子。此外，通过检测THAPll对原癌基因c-myc的影响，我们发现其对c-myc无论是在mRNA水平还是蛋白水平均可抑制其表达，这更加确证了THAPll为候选抑癌基因。 结论： 1)检测了中国汉族正常人群的THIPll基因的CAG重复序列的正常变动范围为22-34，明确了其CAG重复数构成的各种基因型及分布等特征。 2)通过对具有-神经退行性病变的患者的THAPll基因中CAG重复数的筛查，发现了1例神经退行性病变的患者其THAPll基因中含有38个CAG重复，从而初步提示其发病可能与多聚谷氨酰胺疾病有关联； 3)通过对含异常扩增CAG(38)的THAPll基因进行功能研究，发现该突变基因细胞内表达可产生核内包涵体这一多聚谷氨酰胺疾病的特征性病变，同时还存在对细胞周期G0/Gl期明显阻滞，进一步提示其为多聚谷氨酰胺疾病的候选致病基因。 4)发现THAPll可能具有转录抑制功能，同时该基因在癌组织表达水平较癌旁组织低，并可抑制原癌基因c-myc的表达，提示THAPll为候选抑癌基因。

目录

论文说明：英文缩略词

声明

1.前言

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1实验仪器

2.1.2实验试剂

2.1.3细胞株

2.1.4载体

2.1.5菌株

2.2方法

2.2.1细胞培养

2.2.2蛋白提取

2.2.3 Western Blot分析

2.2.4提取RNA

2.2.5逆转录PCR

2.2.6制备细菌感受态

2.2.7构建重组质粒

2.2.8细胞转染

2.2.9流式细胞仪检测细胞周期

2.2.10染色质形态检测技术

2.2.11细菌培养相关溶液

2.2.12基因组DNA提取

2.2.13 THAP11基因的siRNA的合成与转染

2.2.14 Real time-PCR检测

3.实验结果

3.1 THAP11作为多聚谷氨酰胺疾病候选致病基因的功能研究

3.1.1 THAP11序列、结构和同源性分析

3.1.2 THAP11的在各细胞系表达情况

3.1.3 THAP11基因中三核苷酸CAG重复数目的筛查

3.1.4含不同多聚谷氨酰胺数目的THAP11的亚细胞定位

3.1.5 THAP11预测核定位信号的验证

3.1.6 THAP11(38Q)蛋白随时间推移的细胞定位

3.1.7含不同polyQ数目的THAP11对细胞周期的影响

3.1.8含不同po1yQ数目的THAP11对细胞周期蛋白的影响

3.2 THAP11作为候选抑癌基因的功能研究

3.2.1 THAP11对染色质形态的影响

3.2.2 THAP11在肝癌及癌旁组织的表达

3.2.3 siRNA干涉THAP11效果及对c-myc影响

4.讨论

4.1 THAP11作为多聚谷氨酰胺疾病候选致病基因的功能研究

4.2 THAP11作为候选抑癌基因的功能研究

5.结论

参考文献

附录 个人简历

致谢

综述 多聚谷氨酰胺疾病致病机制的研究进展