原发免疫性血小板减少性紫癜血小板蛋白组学诊断模型的研究

摘要

背景：免疫性血小板减少性紫癜( Immune thrombocytopenic purpura,ITP)是一种临床常见的免疫介导的出血性疾病,包括原发免疫性血小板减少性紫癜(primary immune thrombocytopenic purpura, pITP )和继发免疫性血小板减少性紫癜(secondary immune thrombocytopenic purpura,sITP).其病因及发病机制至今都不是很明确,免疫调节异常和自身抗体的产生可能发挥重要作用。pITP是指原因不明的原发性血小板过度破坏的自身免疫性血小板减少综合症,以皮肤出血、血小板计数减少、巨核细胞发育障碍、血小板生存时间缩短及血小板膜糖蛋白特异性自身抗体出现为特征,且早期并无特征性表现,脾肿大也不明显,只有血小板计数减少的血象改变,实验室检查没有特异性指标,故其诊断仍是临床排除性诊断。sITP是指在某些原发病的基础上发生的免疫性血小板减少伴随临床出血的症候群,主要有疾病相关和药物诱导两种类型,如系统性红斑狼疮相关、奎宁诱导等。其临床表现与pITP相似,早期难以鉴别。因此,建立一种能够早期诊断ITP的特异性实验室诊断方法是当前临床亟待解决的一个课题,具有重要的临床意义和现实意义。
目的：本研究旨在探索一种简单快速、灵敏度高、特异性好的ITP实验诊断方法,为ITP的诊断、病情监测、预后评价及个性化医疗提供新的实验室依据。拟采用差异蛋白组学的方法,利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术(surface enhanced laser desorption/ionization-time of flight-mass spectrometry,SELDI -TOF - MS)检测pITP、系统性红斑狼疮、白血病、再生障碍贫血及正常人血小板蛋白质谱,分别筛选出 ITP和非ITP,pITP和sITP的差异蛋白质组,再结合人工神经网络(artificial neural network , ANN)建立诊断模型和鉴别诊断模型,并用SPSS17.0进行盲法验证。
方法：1.样本收集：收集分别患有pITP、系统性红斑狼疮、白血病、再生障碍贫血等疾病的患者及正常人血液标本各60例,各疾病组符合国际疾病分类与诊断标准第十版(ICD-10)的诊断。从收集的标本中提取血小板蛋白质裂解液,并于-80℃冻存。2. 随机分组：将各疾病组及正常人组标本分别按编号用随机数字表法分组为训练集和验证集。训练集用于筛选ITP的差异蛋白标志物并建立ANN诊断模型,验证集用于模型诊断效度的盲法验证。3. 样本检测：应用SELDI蛋白芯片技术及其配套的金芯片(Gold Chip)检测样本,得到相应的蛋白质指纹图谱。4.筛选差异的蛋白(P<0.01)：分别筛选出ITP和非ITP之间,pITP和sITP之间的差异蛋白。5.建立模型：利用人工神经网络对筛选出的差异蛋白进行数据挖掘并建立ITP诊断模型和鉴别诊断模型。6. 盲法验证及效能评价：利用SPSS17.0进行模型的盲法验证及效能评价。7.差异蛋白初步鉴定：结合Swiss-Prot蛋白数据库对差异蛋白初步鉴定和分析。
结果：1. ITP和非ITP：筛选出5个最具差异性的蛋白质峰,其m/z比分别是3358、3400、3442、3493、9294。这些蛋白质ITP中均高表达。利用人工神经网络建立ITP诊断模型,其灵敏度为71.6%,特异度为80.7%,。盲法验证其灵敏度为70.0%(42/60),特异度77.8%(70/90),准确度为76.0%(112/150),ROC曲线下面积为0.806。2.pITP和sITP：筛选出5个最具代表性的差异蛋白,其m/z分别是2188、2495、3461、5156、7555。其中pITP组m/z为3461的蛋白质相对低表达,而m/z为2188、2495、5156、7555的蛋白质在pITP中相对高表达。利用人工神经网络建立鉴别诊断模型,其灵敏度为96.9%,特异度为 71.4%。盲法验证其灵敏度为 80%(27/30),特异度为 70%(21/30),准确度为80%(48/60),ROC曲线下面积0.864。 经蛋白数据库 swiss-protein 检索,得到可能与 ITP 发生有关的蛋白为：Neuropeptide S、Histatin-1、Leukocyte-specific、C-type lectin domain和C-C motif chemokine 18。
结论：基于血小板蛋白质谱图建立的人工神经网络诊断模型对ITP的临床诊断和分子病理研究具有重要的参考价值,并为ITP的发病机制提供了新思路。

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中文摘要

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前言

1．ITP的分类[1,2]

2.pITP概述

3．sITP概述

4．血小板蛋白组学研究现状：

材料与方法

1 实验材料与仪器

2． 实验试剂

3 研究技术路线图（见图1）

4试验方法

结果

1．二维内标校准结果

2．差异蛋白的筛出

3．诊断模型和鉴别诊断模型的建立及效能评价

3．模型的盲法验证

4．差异蛋白的初步鉴定结果

讨论

结论

参考文献

英汉缩略词对照

致谢

数据挖掘的研究进展及在临床医学中的应用

在读期间发表的论文

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