电针刺激联合BMSCs移植治疗对脑出血大鼠脑组织内 AQP-4、AQP-9及MMP-9蛋白表达的影响

摘要

目的：电针刺激联合骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)移植治疗脑出血(Intracerebral Hemorrhage, ICH)大鼠,观察出血灶周边脑区脑水肿相关蛋白水通道蛋白4(aquaporins-4,AQP-4)、水通道蛋白 9 ( aquaporins -9 , AQP-9 )、基质金属蛋白酶 9 ( matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表达变化,探讨通过联合治疗能否促进脑出血大鼠出血灶周边脑区水转运,减轻脑水肿,改善神经缺失症状。方法：1.建立脑出血大鼠模型：利用脑立体定位仪向SD大鼠右侧尾状核区注射肝素+Ⅰ型胶原酶诱导脑出血模型,于术后2h、24h、48h进行三次神经损害程度评分(Neurological severity score,NSS 评分),任意一次评分大于 9分者入选实验组。2. 培养骨髓间充质干细胞(BMSCs)：将冷冻保存并已作GFP标记的BMSCs进行复苏、传代,当生长至细胞融合度为80%左右时,换预诱导液诱导24h,于移植前6h改用无血清诱导液诱导,移植时收集细胞,调整细胞浓度至2.5×107个/ml用于移植。3.实验动物分组：生理盐水组(Control组),造模后第3d沿相同手术入路向右侧尾状核区注入生理盐水20μl；细胞移植组(BMSCs组),造模后第3d往出血灶内移植BMSCs 20μl；电针治疗组(electro-acupuncture therapy,Ea组),造模后第3d开始以连续波、频率3Hz、强度1V的电针刺激大鼠百会穴和大椎穴,每天1次直至处死动物；电针刺激联合细胞移植组(electro-acupuncture combined with BMSCs transplantation,Ea-BMSCs 组),造模后第 3 天往出血灶移植BMSCs 20μl,细胞移植后2h开始电针刺激,之后同电针治疗组处理方法一致。4.按分组后喂养的时间不同将各组动物再分为1d、3d、5d、7d及14d 5个亚组,在相应时间点采血,收集血清,处死动物取出脑组织。5.采用免疫组化 SABC 法观察 AQP-4、AQP-9 及 MMP-9 在脑组织中的分布；Western-blotting检测AQP-4在出血灶周边脑区的表达变化；干湿法检测出血灶周边脑组织水含量；放射免疫法( RIA )测定血清中白细胞介素 2 (Interleukin-2,IL-2)的含量。结果：1.出血灶周边脑组织水含量：①各组模型脑组织水含量在第3d开始升高,第5d达到峰值。②Ea组各时间点脑组织水含量均低于其余各组(p<0.05)。③Ea-BMSCs组只有5d、7d组脑组织水含量低于Control组(p<0.05)。④Ea-BMSCs组与BMSCs组之间比较未见统计差异。2.出血灶周边区脑组织AQP-4的表达变化：(1)免疫荧光双标显示,AQP-4阳性物质表达于出血灶周边脑区胶质酸性纤维蛋白(GFAP)阳性细胞上。(2)免疫组化检测出血灶周边脑区 AQP-4 阳性产物的OD值(平均光密度值)：①Control组、BMSCs组和Ea BMSCs组AQP-4蛋白在第3d开始升高,于第5d达到峰值,BMSCs组和Ea-BMSCs组在第 7d 后再度升高,而 Control 组和 Ea 组在达峰值后未见升高。②Ea-BMSCs组和BMSCs组在第1d、5d蛋白表达均低于Control组(p<0.05),在第14d表达却高于Control组(p<0.05),且Ea-BMSCs组第 1d、5d的表达低于BMSCs组(p<0.05),而第14d蛋白的表达与BMSCs组比较无统计学差异。(3)Western-blotting检测出血灶周边AQP-4阳性物质的灰度值：3.出血灶周边区脑组织AQP-9的表达变化：免疫组化检测出血灶周边脑区AQP-9阳性产物OD值显示,①Control组、BMSCs组和Ea-BMSCs组AQP-9蛋白在第1d开始升高,于第3d和7d第两次达到峰值,而Ea组只于第7d达到峰值；②第3d,Ea-BMSCs组AQP-9表达高于Control组、BMSCs组和Ea组(p<0.05),而BMSCs组与Control组和Ea组之间比较无统计学差异；③第7d,Ea组、Ea-BMSCs组和BMSCs组AQP-9表达均高于Control组(p<0.05),Ea-BMSCs组AQP-9表达高于Ea组,且具有统计学差异(p<0.05),但Ea-BMSCs组与BMSCs组之间比较差异无统计学意义。4. 出血灶周边区脑组织 MMP-9 的表达变化：(1)免疫荧光检测可见,MMP-9阳性产物主要表达于出血灶及周边脑区,且随着时间的推移,阳性表达产物逐渐减少。(2)免疫组化检测出血灶周边脑区 MMP-9 阳性产物OD值显示,①Ea-BMSCs组和BMSCs组MMP-9表达于第1d开始升高,第3d达到峰值,之后缓慢下降,Ea-BMSCs组于第7d开始出现上升的趋势。Control组和Ea组一直呈现缓慢下降的趋势。②在第1d,Ea-BMSCs组和Ea组显著低于BMSCs组和control组(p<0.05),但Ea-BMSCs组和Ea组之间比较以及BMSCs组和control组之间比较,未见统计学差异。③在第3d,Ea-BMSCs 组和 Ea组 MMP-9 表达低于 control组(p<0.05), Ea-BMSCs组高于Ea组(p<0.05)；BMSCs组高于control组(p<0.05)。④在第14d,Ea-BMSCs组和BMSCs组MMP-9表达均高于control组(p<0.05),Ea组低于control组(p<0.05),但Ea-BMSCs组、BMSCs组组间比较未见统计学差异。5.血清IL-2含量：①在第1d,各组之间含量无差异；②从第 3d 开始,BMSCs 组显著高于其余各组(P<0.05),而后迅速降低,于第5d与control组相近,随后开始升高。③从第5d开始,Ea-BMSCs组 IL-2 表达才显著高于 control 组和 BMSCs 组(P<0.05),且该组 IL-2的含量一直在较高水平上缓慢下降；④Ea 组在第 3d 与其余各组比较出现显著降低(P<0.05),但从第5d开始高于移植组和control组(P<0.05),于第14d显著增高,与其余各组相比,P<0.05。结论：1.电针联合BMSCs移植可在脑出血急性期抑制AQP-4的表达,减轻局部脑水肿,急性期后可促进 AQP-4 表达上调,加快水的跨膜转运,促进水肿消散。2.电针联合BMSCs 移植可在脑出血后期上调 AQP-9 的表达,加快脑水肿的消散和促进脑能量代谢的恢复。3.BMSCs移植治疗早期可促进 MMP-9 的表达,加重脑水肿,BMSCs移植后辅以电针治疗可降低MMP-9的表达,减轻移植排斥反应。4. BMSCs治疗可引起血清IL-2含量显著升高,推测BMSCs移植可能诱发移植物抗宿主反应,采用电针联合BMSCs治疗可降低血清IL-2水平,减轻移植排斥反应。

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中文摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 ICH大鼠出血灶周边脑区脑组织水含量测定

2 AQP-4在ICH大鼠脑组织内的表达与分布

3 出血灶周边脑区AQP-9表达

4 出血灶周边脑区MMP-9表达

5 血清白细胞介素-2（IL-2）的表达变化

讨论

1．大鼠脑出血模型的选择

2 水通道蛋白与脑出血后脑水肿的关系

3 MMP-9与脑出血后脑水肿的关系

4、电针刺激联合BMSCs移植治疗脑出血对出血周边脑区AQP-4、AQP-9、MMP-9蛋白表达的影响

5 联合治疗对血清白细胞介素-2表达的影响

结论

参考文献

英汉缩略词对照表

致谢

基质金属蛋白酶参与脑出血后脑水肿的研究进展

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