骨髓间充质干细胞促进脐血CD34+细胞体外扩增、体内植入以及重组逆转录病毒载体和HOXB4高表达的实验研究

摘要

全文分为三部分： 第一部分：人骨髓间充质干细胞促进脐血CD34+细胞的体外扩增和植入非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠 目的：研究人骨髓间充质干细胸(MSC)对脐血CD34+细胞体外扩增的促进作用，以及扩增后脐血细胞植入NOD/SCID小鼠的能力。 方法：分离、培养正常人的骨髓MSC。用培养至第3代的MSC作为饲养层细胞，联合血小板生成素(TPO)、干细胞因子(SCF)、flt3/flk2配体(FL)和粒细胞一集落刺激因子(G-CSF)扩增脐血cD34+细胞。比较有或无MSC饲养层细胞条件下，脐血CD34+细胞经1或2周的体外扩增后，总细胞(TC)、CD34+细胞和集落形成单位(CFU)数的增加倍数。并分别将扩增前、后脐血细胞移植非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠，比较扩增和非扩增脐血细胞重建受鼠造血的能力。 结论：用人骨髓MSC为作为脐血CD34+细胞体外扩增的饲养层细胞，联合细胞因子FL、TPO、SCF和G-CSF，不但可以更加有效地扩增TNC、CFU和CD34+细胞，而且扩增后脐血细胞移植NOD/SCID小鼠后，可以促进脐血细胞在受鼠体内的短期植入，有利于加速扩增后脐血细胞移植NOD/SCID造血重建。人骨髓MSC为作为饲养层细胞扩增脐血细胞的方法有潜在的临床应用价值。 第二部分 重组逆转录病毒的构建和目的基因高表达的研究 一、制备重组HOXB4逆转录病毒及HOXB4高表达的实验研究 目的:建立的HOXB4重组逆转录病毒的生产、浓缩和感染体系。并检测重组逆病毒感染k562细胞的HOXB4表达水平。 方法：用质粒pCMV-G和pCMV-GP协同转染包装细胞293T-HOX，收集病毒上清液(VcM)。并将VCM高速离心浓缩提高病毒的滴度。采用定量PCR和western blot检测重组HOXB4逆转录病毒感染K562细胞中同源盒基因的表达水平。 结论：成功建立的HOXB4重组逆转录病毒的生产、离心浓缩和感染体系；为今后HOXB4基因对造血干细胞生物学特性及移植影响的研究建立了一个平台。 二、含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的构建 目的： 构建含增强绿色荧光蛋白(EGFP)和潮霉素抗性(Hyg)的重组逆转录病毒载体。 方法：依次将Hyg抗性和EGFP基因片段，插入逆病毒空载体质粒pCMV-LL-SA-2中，构建重组的逆病毒载体质粒pcMV-GFP-hyg。然后将其与质粒pCMV-G和pCMV-GP共转染293T细胞，产生含有目的基因的重组逆病毒。 结论： 成功构建了表达EGFP和Hyg抗性的重组逆转录病毒载体；转染293T细胞后可以产生较高滴度的VCM。 第三部分 建立非肥胖型尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID-βnull)小鼠人白血病模型的实验研究 目的:建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的人白血病细胞株K562，并以此移植非肥胖型尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/DCID)小鼠，建立白血病研究的动物模型。 方法：用含GFP和潮霉素抗性基因的重组逆病毒载体感染人白血病细胞株K562，经潮霉素筛选后得到均一、具有荧光标记的K562(K562-GFP)细胞。应用NOD/SCID小鼠作为实验动物，经2.5Gy的γ射线照射后，从尾静脉注射5×10<'5>个K562-GFP细胞(n=3；第1组)；或1×10<'6>个K562-GFPN胞(n=3；第2组)；或生理盐水作为对照组(n=1)。移植后第6周用流式细胞术(FCM)和PCR检测受鼠体内白血病细胞。 结论：K562-GFP细胞移植NOD/SCID小鼠，成功建立了白血病动物模型，为白血病的相关研究提供了动物模型平台。

目录

声明

第一章 人骨髓间充质干细胞促进脐血CD34+细胞的体外扩增和植入非肥胖性糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠

摘要

前言

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二章重组逆转录病毒的构建和目的基因高表达的研究

第一节制备重组HOXB4逆转录病毒及HOXB4高表达的实验研究

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

第二节含绿色荧光蛋白和潮霉素抗性基因重组逆转录病毒载体的构建

摘要

前言

材料、方法和结果

讨论

参考文献

第三章建立非肥胖型尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID-βnull)小鼠人白血病模型的实验研究

摘要

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

附录

致谢

综述