大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与表达

摘要

抗生素在大肠杆菌病预防及治疗方面有着不可替代的作用，但是随着抗生素的不恰当使用，由耐药菌株引起的人及动物感染性疾病不断增加，大肠杆菌耐药及多重耐药现象已十分严重。主动外排系统可引起细菌对多种抗生素高频率、高水平耐药。在大肠杆菌中发现存在AcrAB、AcrEF、EmrAB、Ecr、QacE等主动外排系统，其中AcrAB-TolC外排泵是大肠杆菌最主要的主动外排系统。AcrAB-TolC包括药物质子转运子AcrB、间质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC。AcrAB的表达水平受多种调控因子的调节，如acrR. marA、mppA、sdiA、rob和soxS等，其中，rob是其中的一个正向调控因子。 选取临床分离的不同动物源性大肠杆菌5株及大肠杆菌药敏质控株ATCC25922，分别以其染色体DNA为模板，通过PCR反应扩增出大肠杆菌多重耐药调控基因rob片段，将上述基因片段分别与克隆载体pMD18-T simple Vector连接，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，对经酶切与PCR反应鉴定为阳性的克隆质粒进行插入片段的核苷酸序列测定。测序结果表明：不同动物源性大肠杆菌的rob基因核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与GeneBank中该基因序列的同源性较高，核苷酸序列同源性在98.7％～99.9％，氨基酸同源性在98.6％～100.0％。rob基因突变位点是否影响了rob对AcrAB-TolC外输泵的调控作用，进而影响其多重耐药水平，还有待进一步研究。 将重组质粒pMD18-T-rob和pPICZαA分别用KpnⅠ和XbaⅠ酶切后构建成表达质粒pPICZαA-rob，构建后的重组质粒电转化进GS115酵母感受态细胞中，阳性重组子甲醇诱导、目的基因酵母表达条件的优化(甲醇浓度、诱导时间、诱导起始OD600值等)以及发酵上清浓缩液的SDS-PAGE电泳分析结果表明大肠杆菌多重耐药调控基因rob在毕赤酵母中能够表达，表达的目的蛋白的分子量约为33 kDa，与预测的分子量大小相符。 本试验获得的临床分离大肠杆菌多重耐药调控基因rob的核苷酸序列同源性比较分析结果，可为深入研究其AcrAB-TolC外输泵的调控机制提供参考；获得的rob基因表达蛋白，将为进一步制备其抗体，建立快速有效的该基因表达水平检测方法，阐明我国临床分离动物源性大肠杆菌的多重耐药机制奠定基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分文献综述

第一章 大肠杆菌耐药分子机制

1抗生素作用位点的改变或新作用位点的产生

2酶对抗生素的修饰和破坏

3细菌细胞膜通透性改变使抗生素不易或无法进入细胞内

4增加抗菌药物从大肠杆菌向细胞外的主动排出

第二章大肠杆菌AcrAB-TolC系统研究进展

1 AcrAB-TolC系统的结构及功能

2 AcrAB-TolC系统的药物外排机制

3 AcrAB-TolC系统的调控机制

第二部分实验部分

实验一大肠杆菌多重耐药调控基因rob的克隆与序列分析

1材料

2方法

3结果

4讨论

实验二大肠杆菌多重耐药调控基因rob的毕赤酵母表达

1材料

2方法

3结果

4讨论

结 论

参考文献

附 录

致 谢

作者简介