重组腺相关病毒介导Smac/DIABLO促进化疗药物诱导MBT-2膀胱癌细胞凋亡的研究

摘要

【目的】 膀胱肿瘤为泌尿系统最常见的肿瘤，在我国其发病率在泌尿系肿瘤中居首位，且大多数膀胱癌表现为多中心性与复发率高的特点。目前临床的治疗手段主要是手术治疗和术后化疗，但复发率较高，而目前常用的化疗药物在使用一段时间后都出现不同程度耐药性，且并发症较多。抗肿瘤化疗的策略主要在于清除肿瘤细胞，尽管其作用机制各异，但化学药物所致胞毒作用的终末效应均为诱导细胞凋亡，而肿瘤细胞对于药物所致的抵抗性是肿瘤治疗失败的主要原因。通过调控凋亡信号转导途径相关的胞内调控因子，将有可能影响肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。因此，本研究以膀胱肿瘤细胞为研究对象，以重组腺相关病毒为载体，介导第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂(Smac/DIABLO)参与凋亡调控，研究膀胱癌细胞对普通化疗药物的抵抗性降低的过程，并从分子水平尝试探讨肿瘤细胞对化疗药物抵抗性降低的分子机制。 【方法】 应用细胞传代培养技术培养获得鼠膀胱肿瘤细胞(MBT-2)后，将转染有第二个线粒体来源的胱氨酸酶激活剂的重组腺相关病毒(rAAV-Smac/DIABLO)加入到培养液中转染 MBT-2 细胞，RT-PCR 法测定 Smac/DIABLO在细胞中的表达情况，当蛋白表达稳定后加入普通化疗药物丝裂霉素诱导凋亡启动，运用四甲基偶氮唑蓝还原反应(MTT法)测定MBT-2细胞增殖的抑制作用，对照比较转染Smac/DIABLO前后化疗药物胞诱膀胱癌细导凋亡的差异。流式细胞仪测定不同加药组对MBT-2膀胱癌细胞的凋亡的诱导情况，所得数据使用SAS9.0统计软件分析。 【结果】 1.rAAV-Smae/DIABLO转染MBT-2肿瘤细胞后RT-PCR检测Smac/DIABLO表达情况 rAAV-Smac/DIABLO 转染 MBT-2 肿瘤细胞后，采用 RT-PCR 法检测Smac/DIABLO 在细胞中的表达量，24小时后有条带出现，48小时后稳定表达。 2.rAAV-Smac转染MBT-2后提高了化疗药物的抑制率 2.1 丝裂霉素对MBT-2肿瘤细胞的抑制情况 MTT检测显示按照浓度梯度加入丝裂霉素，观察对MBT-2肿瘤细胞均有不同程度抑制增殖作用，同空白对照组比较有统计学意义(P<0．01). 2.2 rAAV-Smac/DIABLO转染MBT-2后化疗药物对肿瘤细胞的抑制情况 MTT检测显示转染 rAAV-Smac/DIABLO后48小时联合使用丝裂霉素对MBT-2 肿瘤细胞均有不同程度抑制增殖作用，同空白对照组比较有统计学意义(P<0．01)。 2.3 对2.1和2.2数据进行2×5析因设计的方差分析 对2.1和2.2数据建立2×5的析因设计方差分析统计模型，计算各统计量结果显示 rAAV-Smac/DIABLO 转染因素使肿瘤细胞的抑制率有差别，转染后肿瘤细胞抑制率更高，有统计学意义。(P<0.05) 3.rAAV-Smac转染MBT-2后降低了肿瘤细胞对化疗药物的耐药性(本实验组所用MMC均为0.05mg/ml低剂量诱导凋亡启动) 3.1 化疗药物采用低剂量时，rAAV-Smac/DIABLO+MMC组肿瘤细胞的抑制率最高 采用低浓度丝裂霉素诱导凋亡启动，经MTT检测显示各加药组(空白组、MMC 组、Smac/DIABLO 组、Smac/DIABLO+MMC 组)中Smac组抑制率7.94±1.85；MMC组抑制率9.23±2.23；rAAV-Smac/DIABLO+MMC组抑制率28.38±3.84：rAAV-Smac/DIABLO+MMC 组对肿瘤细胞的抑制率高于其它组，差别有统计学意义。(P<0.01) 3.2 化疗药物采用低剂量时，rAAV-Smac/DIABLO+MMC 组肿瘤细胞的凋亡率最高 采用低浓度丝裂霉素诱导凋亡启动，经流式细胞检测显示各加药组(空白组、MMC组、Smac/DIABLO 组、Smac/DIABLO+MMC 组)中Smac 组凋亡率7.29±1.25；MMC组抑制率5.25±1.21；rAAV-Smac/DIABLO+MMC 组抑制率22.18±1.62；rAAV-Smac/DIABLO+MMC 组肿瘤细胞的凋亡率高于其它组，差别有统计学意义。(P<0.01)其中rAAV-Smac/DIABLO 联合使用丝裂霉素对肿瘤细胞的促凋亡作用最高，二者具有协同效应，凋亡峰明显。(P<0.01) 【结论】 1.rAAV-Smac/DIABLO 能够有效的转染 MBT-2 膀胱癌细胞，大约在转染后48小时表达量达到治疗水平，表达持续稳定。 2.转染了Smac/DIABLO 后普通化疗药物对膀胱癌细胞有更强的抑制作用，提高了化疗药物的抑制率，促进了化疗药物的诱导凋亡作用，化疗因素和Smac/DIABLO 转染因素具有协同作用。

目录

声明

前言

1研究背景

2研究目的

3研究内容

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

综述　第二个线粒体来源的胱氨酸酶活剂Smac/DIABLO与肿瘤

致谢

附录