湖光岩玛珥湖可培养菌群多样性初步研究

摘要

微生物作为物质循环和能量流动的主要参与者，在湖泊生态系统中起着特别重要的作用；湖光岩玛珥湖是典型的、玛珥类型的火山口湖泊，具有非常鲜明、独特的地质和水文环境条件，但有关该湖泊微生物组成的研究还比较少。因此，本研究采用纯培养法和16S rRNA基因序列分析的方法对湖光岩玛珥湖中可培养细菌的多样性进行研究，以了解此类湖泊可培养细菌的多样性。 研究选择了四类7种不同的培养基从湖光岩玛珥湖水体和底泥中分离得到295株细菌，通过水煮法提取分离菌株的DNA，以PCR扩增获得细菌16S rRNA基因，使用四种限制性内切酶(Hin6 I、Hinf I、Mse I、Rsa I)对16S rRNA基因扩增片段分别单酶切、综合酶切，经带型分析和分类后，获得具有代表性的菌株71株。进而根据上述菌株的16S rRNA基因序列构建了分子系统发育树。 结果表明，71个分离菌株属于5个大的系统发育类群：放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、异常球菌-栖热菌门(Deinococcus-Thermus)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)包含8个纲、13个目、18个科、27个属。优势类群为Proteobacteria门(44株，62.0％)其中仅γ-Proteobacteria亚门就已达35株，49.3％；其次是Firmicutes门(17株，23.996)；再次是Bacteroidetes和Actinobacteria(各4株，5.6％)；比例最小的为Deinococcus-Thermus(2株，2.8％)。这些分离物中，5-30、5-2分别代表单胞菌科(Pseudomonadaceae)和莫拉菌科(Moraxellaceae)的新种属；另有5株细菌可能代表对应科目中的新种属：5-3可能代表肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、7-17可能代表β-变形杆菌门未定科(Incertae sedis5)中的新种属和C8可能代表红环菌科(Rhodocyclaceae)的新属以及P8和P2可能代表芽孢杆菌科1亚科(Bacillaceae1)的2个新属。 从以上结果可以看出，湖光岩玛珥湖内细菌存在着其他湖泊常见的类别如Actinobacteria、Proteobacteria和Firmicutes，具有一定的相似性，又出现了些不常见的类别Deinococcus-Thermus，显示出了湖光岩玛珥湖的特异性；并且潜藏着较多的新的微生物类群(物种)，可作为微生物资源新的来源。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1玛珥湖概况

1.2湖泊环境微生物研究信息

1.3水域微生物研究方法

1.3.1分子杂交法

1.3.2克隆基因文库分析法

1.3.3基因指纹图谱技术

1.4研究目的与意义

第二章材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要仪器设备

2.1.2主要试剂

2.2样品的采集

2.2.1采样时间和地点

2.2.2获取纯培养体

2.3 Biolog鉴定系统的鉴定

2.3.1革兰氏染色

2.3.2鉴定系统接种液的配置

2.3.3菌悬液的制备

2.3.4调整浊度

2.3.5接种至鉴定板培养

2.4细菌16S rRNA基因的扩增

2.4.1水煮法提取细菌基因组DNA

2.4.2 16S rRNA基因的PCR扩增

2.5限制性内切酶酶切

2.6丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)

2.6.1胶的制备及电泳

2.6.2银染法染色剂的配制

2.6.3银染法显示DNA条带

2.7克隆测序及系统发育树的建立

2.7.1 PCR产物的纯化

2.7.2感受态细胞的制备

2.7.3 PCR产物的T-A克隆

2.7.4转化

2.7.5阳性克隆的PCR鉴定

2.7.6测序与系统发育分析

第三章实验结果与分析

3.1获得纯培养菌落数

3.2 Biolog鉴定系统鉴定结果

3.2.1代表株菌落的革兰氏染色结果(图3-1)

3.2.2 Biolog鉴定系统鉴定结果(表3-1)

3.3细菌16S rRNA基因PCR扩增结果

3.4四种不同限制性内切酶的酶切图谱

3.5 PCR产物纯化结果

3.6阳性克隆鉴定结果

3.7测序比对结果

3.7.1细菌16S rRNA基因序列测序比对结果

3.7.2细菌16S rRNA基因序列系统发育分析

3.7.3细菌16S rRNA基因序列的同源性分析

第四章讨论

4.1实验方法讨论

4.1.1实验设计

4.1.2培养基的选择

4.1.3 DNA提取方法

4.1.4基于16S鉴定微生物

4.1.5限制性酶切讨论

4.2实验结果讨论

4.2.1 Biolog鉴定结果

4.2.2 16S rRNA基因系统发育及同源性分析结果

结论

致谢

参考文献

导师介绍

作者简历