深海沉积物中甲醛降解菌多样性分析和相关基因的克隆

摘要

深海、南极等极端环境中蕴藏着丰富的资源，其中微生物资源是国内外研究的热点。它们经过长期的进化、选择，在各种极端的环境条件下形成了独特的组织结构、酶系统及代谢机制以进行生存和繁衍。对适冷酶独特的生理结构及机能进行研究，探讨生物适应恶劣的生存环境而产生的解毒机制，无论在科学上还是实际开发应用上都具有重大的意义。由于极端环境样品采集方面的限制，目前大部分的极端微生物仍未得到认识和研究。 本文对东太平洋深海沉积物、印度洋深海沉积物、南极普里兹湾沉积物样品开展研究。采用传统分离微生物手段获得可培养微生物共323株，并从中筛选到83株耐受甲醛浓度在50mg/L以上的甲醛耐受菌株及7株产适冷脂肪酶的菌株。 在甲醛耐受菌中，FA15菌的甲醛耐受能力最强，其在完全生长的条件下，能耐受至少4000mg/L浓度的甲醛，大大高于多数现有文献的记载。同时，FA15菌能在以甲醇或乙醇为唯一碳源的M9培养基上生长，显示了部分“甲基营养菌”的特征。并且将FA15菌体破碎后，其破碎液在3h内能完全降解100mg/L的甲醛。说明FA15菌株发酵产生能够降解甲醛的物质，用于降解甲醛时，不需要FA15活菌，这为实际开发应用提供了极大便利。 同中温酶相比，适冷脂肪酶具有极高的催化常数（Kcat）值，同时有较低和较稳定的米氏常数（Km）值，特别是具有较低的活化能和低温下的酶活力，使其在许多领域有着中温脂肪酶所不可比拟的优越性，因此在洗涤业、食品加工、生物制药、环境生物技术等领域有着广阔的应用前景。本文以7株产脂肪酶菌株为研究对象，应用16S rDNA作为分子指标对其进行分类鉴定，并对其生长与产酶特性、酶学性质进行初步研究，为今后极地微生物适冷酶的低温适应机制研究及其应用打下基础。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章、前言

1.1深海环境与微生物研究进展

1.1.1 深海概况

1.2.2深海微生物研究进展

1.2南极环境与微生物研究进展

1.2.1 南极概况

1.2.2南极微生物研究进展

1.3甲醛的微生物降解现象及其研究进展

1.4微生物脂肪酶的研究进展

1.5细菌16S rDNA及限制性片段长度多态性分析

1.6本论文的思路、目的和意义

第二章、深海沉积物甲醛耐受菌的筛选及FA15菌降解甲醛特性的研究

2.1研究背景

2.2材料与方法

2.2.1 实验材料

2.2.2实验方法

2.3结果与分析

2.3.1 甲醛耐受菌株的多样性分析

2.3.2 FA15性质分析

2.3.3 FA15菌Fosmid基因库的构建及筛选

2.4本章小结

第三章、极地产适冷脂肪酶菌株的筛选及其酶学性质的研究

3.1研究背景

3.2材料与方法

3.2.1 菌种

3.2.2培养基

3.2.3细菌的分离

3.2.4产适冷脂肪酶菌株的筛选

3.2.5酶的提取和纯化

3.2.6脂肪酶酶活测定

3.2.7 16S rDNA分析

3.2.8产适冷脂肪酶菌株酶液酶学性质研究

3.2.9发酵条件研究

3.3结果与分析

3.3.1菌株16S rRNA序列分析结果

3.3.2温度对酶活力的影响

3.3.3酶的温度稳定性

3.3.4 pH对酶活力的影响

3.3.5金属离子对酶活力的影响

3.3.6表面活性剂对酶活力的影响

3.3.7菌株发酵条件

3.4本章小结

第四章、总结与展望

参考文献

致谢