新型抗胆碱药R2HBJJ抑制肺癌细胞增殖作用及机制研究

摘要

肺癌是目前世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率逐年上升。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占肺癌患者的80％以上。尽管外科手术与放疗化疗的联合应用日臻完善,对肺癌的疗效不断提高,但其5年生存率仍低于20%。因此迫切需要发展新的治疗方法。目前研究表明,肺癌细胞能够合成和分泌乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh)作为一种生长因子,构建自分泌促增殖网络,参与并促进肺癌的发展进程。毒蕈碱型胆碱能受体(muscarinic cholinergic receptor,M受体)的M3亚型与烟碱型胆碱能受体(nicotinic cholinergic receptor,N受体)的α7亚型的选择性拮抗剂,均能抑制肺癌细胞中过度激活的胆碱能信号,从而抑制肺癌细胞增殖,为肺癌的预防和治疗提供了新的药物研发策略。R2HBJJ是由抗胆碱药盐酸戊乙奎醚衍生得到的季铵盐,本研究的目的是考查R2HBJJ的抗胆碱特性,评价其对非小细胞肺癌细胞增殖的影响,并探讨可能的作用机制以及用于NSCLC治疗的潜在可能性。结果如下:
　　1.放射性配体受体结合实验表明,R2HBJJ能竞争性抑制[3H]-NMS与M受体结合,抑制作用随药物浓度增加而增强,对M1-5受体的竞争抑制平衡解离常数Ki值依次为7.86±3.39×10-11、1.33±0.52×10-9、6.79±3.71×10-11、1.06±0.12×10-10和2.64±0.98×10-10M(n=3,F=121.2,P<0.01),R2HBJJ对M3和M1受体显示出较高的亲和力。R2HBJJ抑制卡巴胆碱所诱发豚鼠支气管平滑肌收缩的IC50为7.58±1.05×10-9M(n=5)。
　　2.采用全细胞膜片钳记录ACh诱发的大鼠背根神经节(Dorsal root ganglion,DRG)神经元电流,R2HBJJ能浓度依赖性阻断该电流,1μM、10μM、20μMR2HBJJ对电流的阻断率分别为29.31±5.76%、91.35±1.03%、99.07±0.14%(n=3或5)。利用爪蟾卵母细胞分别表达大鼠α7和α9/α10受体,使用双电极电压钳技术记录ACh诱发的电流。100μMR2HBJJ能完全阻断100μMACh诱发的α7受体电流(n=3),200μMR2HBJJ对200μMACh诱发的α9/α10受体电流的阻断率为76.74±6.17%(n=4)。提示R2HBJJ具有阻断DRG神经元N受体以及在爪蟾卵母细胞上表达的大鼠α7受体和α9/α10受体亚型的作用。
　　3.用磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)法测定了R2HBJJ作用后细胞活力变化。R2HBJJ在体外能浓度依赖性地抑制NSCLC细胞H1299、H460和H157生长,作用72h后半数生长抑制浓度GI50依次为8.5±0.15、8.8±0.42、28.5±0.75μM(n=6),但对A549细胞生长无明显抑制作用。R2HBJJ在10-40μM明显抑制肺癌细胞生长的浓度范围内,不抑制正常人支气管上皮细胞BEP2D生长。对其它17种不同组织类型的肿瘤细胞研究显示,不同的细胞对R2HBJJ具有不同的敏感性。
　　4.ACh能浓度依赖性拮抗R2HBJJ对H1299细胞增殖的抑制作用。以正常细胞为对照,分别伴随给予0、0.3、1、3、10、30、100μMACh,细胞活力显著增加,72h后R2HBJJ10μM组细胞活力分别为57.08±1.62%、65.61±4.52%、56.64±7.01%、74.92±5.42%、82.92±6.08%、88.76±0.86%和91.41±3.99%(n=6);R2HBJJ20μM组细胞活力分别为19.67±2.15%、33.37±1.77%、24.53±1.76%、29.88±5.18%、35.72±4.26%、42.37±2.12%和58.17±4.38%(n=6)。
　　5.在H1299、H157、H460、A549和BEP2D细胞上应用RT-PCR方法检测了胆碱能受体(Acetylcholinereceptors,AChRs)和胆碱乙酰转移酶(Cholineacetyltransferase,ChAT)的表达。ChAT在这几种细胞中均有表达;M1-5、α7、α9、α10、β2和β4受体的表达有明显差异,但并没有发现与对R2HBJJ敏感性特异相关的受体亚型表达。
　　6.以H1299细胞为模型,对比R2HBJJ和不同亚型选择性AChRs拮抗剂对其增殖的抑制作用。M3受体选择性拮抗剂达非那新的抑制作用与R2HBJJ相似,但弱于R2HBJJ。α7受体选择性拮抗剂α-Bungarotoxin(α-bgt)和N受体非选择性拮抗剂美加明,在10μM内对H1299生长抑制作用均强于R2HBJJ。M1受体选择性拮抗剂哌仑西平、M2/M4受体选择性拮抗剂AF-DX116、M受体非选择性拮抗剂阿托品、α4/β2和α4/β4受体选择性拮抗剂DhβE抑制作用弱。提示R2HBJJ抑制H1299细胞生长的作用主要由M3受体和α7受体介导,其它受体亚型可能同时参与该过程。
　　7.用流式细胞术(Flowcytometry,FCM)考察了R2HBJJ对细胞凋亡和细胞周期的影响。用20μMR2HBJJ处理H1299细胞24、48、72h,细胞凋亡没有明显变化,但随着作用时间的延长,细胞周期G0/G1期比值由42.54±2.11%上升到76.21±2.75%,而S期则由46.78±1.40%下降到18.37±2.45%(n=3,P<0.01),表明R2HBJJ能时间依赖性诱导H1299细胞产生G0/G1期阻滞。此外,R2HBJJ还能浓度依赖性诱导H1299和H157细胞产生G0/G1期阻滞。
　　8.使用WesternBlot方法,分析了调控细胞周期G1检查点信号网络的关键蛋白及其上游信号分子表达水平的变化。R2HBJJ可时间及浓度依赖性下调cyclinD1、CDK4、CDK6表达,抑制Rb磷酸化,而对cyclinE和CDK2的表达影响小,这表明R2HBJJ诱导的细胞周期阻滞发生在G0/G1的早期。进一步的实验表明R2HBJJ可时间依赖性下调Thr308p-Akt、c-Myc和Ser9p-GSK3β,提示R2HBJJ能在不同机制介导下使得PI3K/Akt通路激活受到抑制,从而导致Akt和它下游的c-Myc和GSK3β的磷酸化水平下调,使得细胞周期蛋白的表达和稳定性发生改变,最终导致细胞周期进程阻滞于G0/G1期。此外,R2HBJJ还能经由JNK通路抑制Tyr705p-Stat3核转位,从而抑制参与G1期向S期转化的下游信号分子转录。
　　本研究表明新型抗胆碱药R2HBJJ对五种M受体亚型有不同的亲和力,但主要选择拮抗M3和M1受体。R2HBJJ能阻断ACh诱发的DRG神经元电流以及在爪蟾卵母细胞上表达的α7受体和α9/α10受体电流。R2HBJJ通过拮抗M受体和N受体而抑制NSCLC细胞增殖,ACh能浓度依赖性阻断R2HBJJ的抑制作用。R2HBJJ主要经由PI3K/Akt通路下调细胞周期G1检查点调控蛋白Ser807/811p-Rb、cyclinD1、CDK4和CDK6的表达,诱导细胞发生G0/G1期阻滞。此外,R2HBJJ还能经由JNK通路抑制Tyr705p-Stat3核转位,从而抑制参与G1期向S期转化的下游信号分子转录。R2HBJJ诱导NSCLC细胞发生G0/G1期阻滞是其抑制细胞增殖的主要机制,但其体内抗肿瘤作用仍需进一步研究。本研究为非神经元胆碱能系统参与NSCLC细胞增殖的调控提供了新的佐证,并为新型抗胆碱药R2HBJJ用于NSCLC治疗的潜在可能性提供了实验依据。

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前言

第一章：R2HBJJ抗胆碱特性研究

材料

方法

结果

讨论

第二章：R2HBJJ体外抑制肺癌细胞增殖作用及机制研究

材料

方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

[参考文献]

论著

[参考文献]

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