接触系统对人血管内皮细胞影响的研究

摘要

背景危重病的本质是过度炎症,而炎症发生时,一部分血管内皮细胞受到入侵微生物毒性产物和炎性细胞因子的攻击而发生凋亡,使血管内皮屏障被破坏,产生毛细血管渗漏综合征；其余的血管内皮细胞则发生功能改变,由静息状态转为激活状态,表现为促凝、促炎和改变血管张力,对炎症起放大作用。因此,血管内皮细胞在炎症中的关键地位使其成为危重病研究的必不可少的工具。
　　 炎症可以导致凝血途径的激活,一些细胞因子可以促进凝血；凝血反过来又可以通过激活蛋白酶激活的受体进一步加重炎症。目前认为在凝血和炎症的相互作用中,外源性凝血途径起主要作用,而内源性凝血途径无论在凝血过程还是在炎症中都只有辅助作用,处于从属地位。但是炎症和内源性凝血途径与补体、纤溶等系统形成复杂的相互作用的扁平网络结构,从理论上推测内源性凝血途径也可以直接影响炎症的进程。内源性凝血途径的起始部分被称为接触系统,由高分子量激肽原(HMK)、前激肽释放酶、XⅡ因子和XⅠ因子组成,可以被内毒素激活。我们试图通过观察接触系统对血管内皮绌胞的炎症活性、凋亡以及Toll样受体表达的影响,探讨内源性凝血途径对炎症的作用。
　　 方法首先以接触系统的组成成分及其激活后的产物FXⅡa、FXⅠa、激肽释放酶等刺激人内皮细胞株EA.hy926,制备细胞裸核并在核膜上穿孔,然后用抗人p65的单克隆抗体与转移到细胞核内的p65结合,再以荧光标记的二抗共同孵育。得到的标本采用流式细胞术测量内皮细胞核内特定的荧光强度；另外以流式细胞术测量表达细胞间粘附分子1(ICAM-1)的细胞比例的变化。
　　 仍旧以接触系统刺激EA.hy926细胞,并设立内毒素阳性对照组,采用AnnexinV法,用流式细胞术观察处理后5小时中内皮细胞的早期凋亡率及其时相变化。
　　 分离、培养人脐静脉内皮细胞,采用逆转录聚合酶链反应和实时荧光定量PCR观察接触系统刺激之后人脐静脉内皮细胞的Toll样受体2和4表达的改变。
　　 结果实验结果显示,本实验采用的制备细胞裸核用流式细胞术测量NF-k B活性的新方法稳定、可靠。实验说明,在接触系统的组成成分中,只有游离的FXⅠ或其活性形式FXⅠa能够使EA.hy926细胞核内的p65荧光强度显著升高,提示游离的FXⅠ和FXⅠa可以活化内皮细胞,使内皮细胞的NF-kB转为活性形式。但同时实验结果显示只有FXⅠa在活化NF-kB的同时可以显著提高表达ICAM-1的细胞的比例。这表明接触系统在一些特定情况下可以直接作用于炎症。
　　 游离的FXⅠ具有导致内皮细胞凋亡的作用。以FXⅠ刺激EA.hy926细胞后,2小时内细胞的早期凋亡率就可以明显升高,5小时后又有显著升高。相反,FXⅠa不能导致内皮细胞凋亡。另外,大剂量LPS可以单独导致EA.hy926细胞的早期凋亡率显著提高,其时相变化与FXⅠ导致的凋亡时相变化一致。
　　 以接触系统的成分刺激体外培养的人脐静脉内皮细胞,稳定地表达Toll样受体4,各组之间没有明显差别,与阴性对照组之间亦无差别；而无论接触系统刺激与否,人脐静脉内皮细胞都不表达Toll样受体2。
　　 结论接触系统作为内源性凝血系统的起始部分,除了其产物缓激肽外,还可以在FXⅠ和FXⅠa两个层面作用于炎症的关键细胞血管内皮绌胞,显示接触系统的激活不仅仅是一个凝血过程,而且具有多种影响炎症的能力。其中,FXⅠ和FXⅠα都可以导致内皮细胞NF-kB的活化。FXⅠa进一步能够引起内皮细胞ICAM-1的表达增加,说明FXⅠa的刺激可以使内皮细胞转为炎症激活状态；游离的FXⅠ作为HMK激活的结果,可以导致内皮绌胞的凋亡。这些结果说明接触系统全面参与了炎症时内皮细胞的功能和形态变化。FXⅠ和FXⅠa对血管内皮细胞的作用机制还不清楚。我们的试验也说明,接触系统的这些效应不是通过toll样受体介导的。

目录

文摘

英文文摘

引言

第一部分 接触系统对人血管内皮细胞炎症活性的影响

材料和方法

结果

讨论

第二部分 FXI和FXIa对血管内皮细胞早期凋亡的影响

材料和方法

结果

讨论

第三部分 接触系统对人内皮细胞Toll样受体2、4表达的影响

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述

参考文献

论著