精子肽的合成及ELISA检测方法的建立和初步应用

摘要

据报道，免疫性不孕最近几年发病率逐年上升。研究表明抗精子抗体是导致免疫性不孕的重要原因之一，抗精子抗体的检测方法很多，其中临床上又以酶联免疫吸附测定(ELISA)应用较广泛。该方法通常是利用具正常生育能力者的精子直接包被酶标板或制成包被抗原来包被酶标板，但其稳定性和重复性不理想，且精子来源有限,从而限制了它在临床上的推广应用。固相多肽合成技术的发展为解决这一问题带来了希望，据文献报道，我们选取了5条特异性精子肽，采用固相多肽合成法(solid phase polypeptide synthesis SPPS),以N-a-Fmoc-氨基酸为原料，Fmoc-aa-Wang树脂为固相载体，20％六氢吡啶的DMF溶液为脱保护试剂，以TBTU/HoBT作为偶联试剂/活化剂,经过脱保护-洗涤-缩合-洗涤循环步骤，从C端-N端的顺序依次偶联氨基酸,直至所需目的肽段，最后由切肽试剂将合成多肽从树脂上裂解下来，同时脱去所有侧链保护基团，最终合成了5条特异性精子肽.所得粗肽再经过离子交换层析和反相高效液相色谱纯化鉴定，得到了纯度>95％的精子肽。 利用5条合成肽分别包被酶标板建立ELISA方法检测抗精子抗体，结果表明，各肽段抗体反应性存在明显的差异。因此，我们选择了2个高抗体反应性的肽段（YLP12,P69），并建立了以组合肽为包被抗原的检测抗精子抗体的ELISA方法，与商品化的抗精子抗体酶联免疫检测试剂盒相比，结果显示，组合肽包被的ELISA方法与商品化试剂盒检测结果二者有良好的符合率，统计学分析并无明显差异。我们所建立的间接ELISA方法的批内变异和批间变异均符合精密度的标准要求。4℃保存6个月测定结果无明显差异。该实验表明合成多肽抗原可以取代整精子或精子抗原用于抗精子抗体的血清学检测，在免疫性不孕诊断应用中具有实际临床意义。