Ad-hBMP-2对兔成骨细胞生物学行为影响的体外实验研究

摘要

目的： 检测Ad-hBMP-2在体外环境下对成骨细胞的生物学行为的影响，为Ad-hBMP-2和成骨细胞复合生物材料用于临床治疗骨缺损或整形用骨提供实验依据和理论指导。 方法： 1．应用人胚肾293细胞作为包装细胞，扩增携带hBMP-2表达片段的重组腺病毒载体Ad-hBMP-2，利用氯化铯密度梯度超速离心法对其进行纯化，应用50％感染量测定(infectious dose 50，ID<,50>)方法对纯化的病毒液进行病毒滴度测定。 2．以新生(出生后1-3天)新西兰大白兔颅骨骨膜培养出的成骨细胞为细胞模型，通过倒置相差显微镜观察、四唑盐比色法(MTT法)检测、碱性磷酸酶(Alkali phosphate，ALP)活性测定、免疫细胞化学测定、RT-PCR检测和茜素红染色等方法观察Ad-hBMP-2转染后的成骨细胞和对照组成骨细胞的形态、生长、增殖、成骨功能的差异。以期对Ad-hBMP-2在骨组织工程临床的广泛应用提供实验依据。 结果： 1．本实验成功培养了293细胞，并扩增和纯化了Ad-hBMP-2，所得到的纯化的病毒滴度为1.58×10<'11>pfu/ml。 2．免疫细胞化学染色：5天时Ad-hBMP-2转基因组hBMP-2单克隆抗体染色，胞浆呈现棕黄色异染，即阳性。对照组(未转染组)呈现阴性。 3．RT-PCR(reverse transcription—polymerase chain reaction，逆转录一聚合酶链式反应)结果：Ad-hBMP-2转染组细胞RT-PCR结果阳性，对照组RT-PCR结果阴性。 4．倒置相差显微镜观察，转染Ad-hBMP-2后，细胞明显变大、细胞分裂相增多、细胞内颗粒增多。 5．MTT(methyl thiazolyl tetrazolium，甲基噻唑基四唑)法检测细胞增殖情况，Ad-hBMP-2转染组细胞增殖加快。从第三天开始差异有统计学意义(p<0.05)。从第五天开始差异有显著的统计学意义(p<0.01)。 6．碱性磷酸酶活性检测：Ad-hBMP-2转染组碱性磷酸酶活性高于对照组。从第三天开始差异有统计学意义(p<0.05)。从第五天开始差异有显著的统计学意义(p<0.01) 。 7．Ad-hBMP-2转染组钙化结节形成时间短于对照组。差异有统计学意义(p<0.05)。 结论： 1．成功培养了293细胞，利用293细胞成功扩增了Ad-hBMP-2，并对其进行纯化和滴度测定，得到了高滴度的纯化病毒液，为骨组织工程提供了一种扩增细胞因子的实验方法。 2．Ad-hBMP-2成功转染成骨细胞，hBMP-2在成骨细胞内成功表达。 3．Ad-hBMP-2能明显促进体外培养的兔成骨细胞生长、增殖。Ad-hBMP-2能促进成骨过程。其机制可能与促进成骨细胞内碱性磷酸酶活性升高有关。

目录

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英文缩写词表

前言

实验一 Ad-hBMP-2的扩增、纯化、滴度测定

实验二 Ad-BMP-2对兔成骨细胞生物学行为的影响

结论

附图

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章