肝素、透明质酸和海藻糖对中期保存角膜的保护作用研究

摘要

角膜保存技术增加了角膜移植的有效性。角膜保存的方法包括角膜深低温保存、器官培养、中期保存和湿房保存。目前应用广泛的主要是角膜中期保存和器官培养的方法，器官培养主要在欧洲眼库应用。中期保存的方法操作简单方便，目前国际公认的Optisol-GS液的保存期限长达三周，一般在应用时维持两周内保存。中期保存液的成分包括基础培养液、高分子聚合物、缓冲体系、抗生素以及其它利于维持组织活性的添加成分。高分子聚合物对保存期间角膜活性的维持具有重要作用，而同时含有硫酸软骨素和低分子右旋糖酐是目前角膜中期保存液的最基本类型。结合肝素、透明质酸以及海藻糖的性质和生物活性，本研究主要探讨肝素、透明质酸以及海藻糖对角膜的保护作用，将它们应用于角膜中期保存液，以期能在保存期间较好地维持角膜组织活性，甚至延长角膜保存时间。课题研究内容包括肝素、透明质酸、海藻糖应用于角膜中期保存液的处方研究，含肝素和透明质酸的角膜保存液对离体角膜的保护作用研究以及含肝素和透明质酸的角膜保存液保护角膜作用机制的初步研究三个方面。1 肝素、透明质酸和海藻糖应用于角膜中期保存液的处方研究 肝素、透明质酸、海藻糖用于兔角膜保存，进行处方单因素试验，每因素设立低中高三个水平，通过角膜内皮细胞茜素红一台盼蓝染色进行保存7天和21天的角膜内皮细胞活性评价。随保存时间的延长，角膜内皮细胞活性率降低。与硫酸软骨素对照组相比，透明质酸和肝素各浓度均显示改善角膜保存的作用。海藻糖作用较肝素和透明质酸的保护作用弱，但仍具有一定活性，且与其应用浓度相关。进一步联合应用肝素、透明质酸、海藻糖，进行多因素处方筛选。依据均匀设计筛选处方，运用细胞培养模拟角膜保存环境，通过MTT的方法量化筛选，获得肝素、透明质酸以及海藻糖的最佳应用浓度。其中肝素浓度为0.2％，透明质酸(Mr 310,000)浓度为0.1％，海藻糖在结果优化过程中被剔除，在设计浓度范围内方程显示海藻糖对细胞活性影响不大。 2 含肝素和透明质酸的角膜保存液对离体角膜保护作用研究 将含0.2％肝素和0.1％透明质酸的培养液应用于角膜组织中期保存，并进行处方微调。利用茜素红一台盼蓝联合染色以及扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)的方法进行组织活性评价。结果显示，透明质酸和肝素在角膜4℃保存条件下有利于细胞活性的维持。APD组(含透明质酸、肝素和右旋糖酐的保存液)和APCD组(含透明质酸、肝素、硫酸软骨素和右旋糖酐的保存液)保存21天的兔角膜内皮细胞经茜素红一台盼蓝染色的活性率分别为90.2％和89.4％，与D组(含右旋糖酐的保存液)内皮细胞活性率相比差异具有统计学意义(P<0.05)。电镜结果显示，各组角膜经保存后的水肿情况不明显，角膜内皮细胞间连接结构清晰，超微结构保持较完整。APD组和APCD组结构形态维持上要稍强于CD组(含硫酸软骨素和右旋糖酐的保存液)以及D组，总体超微结构比较差别不是很大。 3 含肝素和透明质酸的角膜保存液保护角膜作用机制的初步研究 3.1角膜保存过程中的细胞凋亡 应用Hoechst 33258荧光染色剂对保存4、7、10天的角膜行组织切片染色，以示凋亡细胞形态和阳性数。实验各组角膜随保存时间的延长，凋亡细胞数增加，保存至第10天APD组、APCD组、CD组的细胞凋亡率分别为5.03％，6.88％和7.51％，与D组凋亡率12.0％相比均有显著性差异(P<0.01)。结果说明在保存介质中联合应用肝素和透明质酸对保存过程中的角膜细胞凋亡具有抑制作用。 3.2角膜保存过程中一氧化氮(NO)的释放 用试剂盒测定角膜保存20天过程中保存液中NO的释放量及其变化。保存介质中NO含量随角膜保存时间的延长而增加。角膜保存20天后各组介质中NO含量分别为APD组(5.56±0.84)μmol/L，APCD组(6.37 4-0.86)gmol/L，CD组(6.71±1.26)gmol/L，D组(7.05±1.31)pmol/L。各组NO释放变化从统计学上没有差异，APD组、APCD组、CD组相对比D组含量稍低。从各组NO含量及变化曲线的对数趋势拟和情况来看，NO含量对数趋势比较后，显示D组>APCD组>CD组>APD组，说明肝素和透明质酸的加入对NO的释放积累有一定的抑制作用，但作用不明显。 3.3角膜保存过程中溶酶体酶的释放 用试剂盒测定角膜保存20天过程中保存液中溶酶体酶的释放及其变化。两种溶酶体β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)以及酸性磷酸酶(ACP)在角膜保存过程中随保存时间的延长其在保存介质中的含量不断增加。各组角膜保存至20天，介质中NAG的含量分别为APD组(1.01±0.16)U/L，APCD组(1.20±0.39)U/L，CD组(1.25±0.60)U/L，D组(1.41±0.24)U/L，三种糖胺聚糖对组织NAG的释放状况有不同程度的减轻。其中APD组NAG含量与D组经t检验比较差异具有统计学意义(P<0.05)。角膜保存20天后各组介质中ACP的含量分别为APD组(5.14±2.04)U/L、APCD组(5.19±2.13)U/L、CD组(5.23±1.81)U/L、D组(6.07±2.71)U/L，三种糖胺聚糖(肝素、透明质酸和硫酸软骨素)对组织ACP的释放也有不同程度的减轻。实验结果说明，透明质酸、肝素以及硫酸软骨素的加入对抑制NAG和ACP的释放有效，总体来说肝素和透明质酸的联合应用组抑制作用强于其他实验组。 3．4保存角膜的明胶酶的表达 应用酶谱检测保存21天角膜的明胶酶表达，以琥珀酰明胶作为底物检测各角膜明胶酶的含量。经明胶酶谱显示保存后各组角膜均表达明胶酶，并且各组角膜在保存过程中向保存介质分泌释放明胶酶，但含量很低。保存角膜2l天后组织明胶酶含量为：APD组(0.11±0.11)μg/ml，APCD组(0.58±0.10)μg/ml，CD组(0.38±0.10)μg/ml，D组(0.44±0.07)μg/ml。APD组明胶酶含量与其他组经，检验比较差异均有统计学意义(P<0.05)。组织明胶酶定量的结果显示肝素和透明质酸联合应用能明显抑制保存角膜组织明胶酶的表达。 本研究得出结论主要有：肝素和透明质酸应用于角膜4℃保存能够较好维持角膜活性。0.2％肝素、O.1％透明质酸，并加入低分子右旋糖苷的中期保存液的高分子组成对维持角膜内皮活性、抑制角膜细胞凋亡、抑制溶酶体酶的释放和组织明胶酶的表达具有有效作用。

目录

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摘要

符号说明

第一章前言

第二章肝素、透明质酸和海藻糖应用于角膜中期保存液的处方研究

第三章含肝素和透明质酸的角膜保存液对离体角膜保护作用研究

第四章含肝素和透明质酸的角膜保存液对离体角膜细胞凋亡的影响研究

第五章含肝素和透明质酸的角膜保存液在角膜保存过程中对NO释放的影响

第六章含肝素和透明质酸的角膜保存液对角膜保存过程中溶酶体酶释放的影响

第七章含肝素和透明质酸的角膜保存液对角膜组织基质金属蛋白酶表达的影响

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的文章