基于UPLC-Q-TOF-MS技术的连花清瘟胶囊药效物质基础研究

摘要

中药是在传统中医药理论指导下应用的天然药物，连花清瘟胶囊2004年被国家食品药品监督管理局（CFDA）批准上市，并于2009年被卫生部推荐用于治疗甲型H1N1流感。近年来的临床研究显示连花清瘟胶囊具有抗炎、免疫调节功能，并能抑制慢性阻塞性肺病急性发作期的气管炎症。在治疗甲型流感病毒感染改善症状方面优于达菲。目前在临床、药理研究方面已进行了较为深入的研究，但连花清瘟胶囊体内药效物质基础不明确。
　　UPLC-MS/Q-TOF–MS是快速而有效的复杂样品分析技术。本实验拟在多组分分析、药代动力学及排泄动力学研究的基础上，分析连花清瘟主要活性成分及可能的代谢产物和转化途径，为其药理学研究提供依据。建立中药复方多成分及其代谢物的 UPLC-MS-MS、UPLC-Q-TOF-MS分析平台，完善连花清瘟多组分的体内外分析方法。测定大鼠口服给药后连花清瘟相关组分的血药浓度，根据药时曲线计算相关药代动力学参数，研究连花清瘟在大鼠体内的药代动力学特征，为其药效物质基础研究提供依据。应用 UPLC-Q-TOF-MS法进行连花清瘟组分连翘苷在大鼠胆汁及尿液中代谢产物的研究，建立连翘苷的体外肝代谢模型，比较体内和体外代谢差异，研究连翘苷不同种属动物与人类之间体外代谢差异，为连翘苷生物体内过程的进一步研究并阐明作用机制提供了理论依据。采用UPLC-Q-TOF-MS技术测定大鼠尿液中8个主要活性成分，进行连花清瘟胶囊大鼠体内排泄研究，为连花清瘟胶囊的研发和药物临床应用的安全性提供依据。
　　第一部分基于UPLC-MS-MS技术的连花清瘟胶囊多组分同时分析
　　目的：建立一种UPLC-MS-MS方法同时测定连花清瘟胶囊中8个活性化合物的含量。
　　方法：取连花清瘟胶囊内容物，研匀，精密称定干膏粉约0.5g，置具塞锥形瓶中，加甲醇100mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，称重，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液进样测定。质谱条件：电喷雾离子源（ESI源），正负离子切换扫描模式，毛细管喷雾电压为3.5kV，脱溶剂气温度为550℃。对每个化合物的CE和CV进行优化， ESI一级全扫描质谱准分子离子峰[M+H]+和二级全扫描质谱子离子分别为：大黄酚 m/z253.0?225.0；大黄素 m/z269.0?225.0；大黄酸 m/z283.0?239.0；芦荟大黄素m/z269.0?240.0；甘草苷m/z417.0?255.0；木犀草素 m/z287.0?153.0；连翘苷 m/z578.8?370.8；红景天苷 m/z299.0?119.0；驻留时间为0.163secs。液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C18色谱柱（2.1×50 mm,1.8μm）；流动相为乙腈（A）-0.1％甲酸水（B），0.4 mL/min梯度洗脱，0~2.5 min，A15%-85%，2.5~4.5 min，A85%~15%；每次进样前以流动相初始条件A15%预平衡3min；流速400μL/min；柱温40℃；进样量8μL。
　　结果：8种化合物在测定浓度范围内线性关系良好，r2>0.99；精密度RSD值小于1.73%，表明方法的精密度良好。平均回收率为92.8%~101.8%，RSD值为1.09%~3.79%；供试品溶液在室温条件下放置12h稳定性良好，RSD值小于2.83%。采用UPLC-MS-MS方法正负离子切换扫描7.5min完成一个分析周期。
　　结论：方法快速简便，灵敏度高，选择性好，可用于连花清瘟胶囊质量控制。
　　第二部分基于 UPLC-MS-MS技术的连花清瘟胶囊在大鼠体内的药动力学特征
　　目的：建立同时测定大鼠体内连花清瘟胶囊组分大黄酸、大黄酚、连翘苷和红景天苷UPLC-MS-MS方法，通过测定大鼠体内血药浓度建立药-时曲线，计算药动力学参数，阐明其药动力学特征。
　　方法：雄性SD大鼠以8.5g/kg剂量灌胃给予连花清瘟混悬溶液，分别于给药前及给药后0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、360、420、480、600min，眼眦静脉丛取血，置肝素化抗凝管中，3500rpm离心10min，取上清液-80℃储存备用。血样样品处理采用液液萃取法，于0.4mL血浆中依次加入5μL内标溶液（5μg/mL氯霉素的甲醇溶液），混匀，加入 HCl（1moL/L）10μL，混匀，加乙酸乙酯1.5mL，涡流混合2min，离心（16000 rpm）10min后，取乙酸乙酯1.5mL，N2吹干，残留物加甲醇100μL，涡旋1min，离心（16000 rpm）10min，0.22μm滤头过滤进行UPLC/MS/MS分析。液相色谱条件：Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C18色谱柱（2.1×50 mm,1.8μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱，0~2.5 min，A15%-85%，2.5~4.5 min，A85%~15%；流速400μL/min；柱温40℃。质谱条件：电喷雾离子源（ESI源），负离子模式，毛细管喷雾电压为3.5kV，脱溶剂气温度为550℃。测得样品中大黄酸、大黄酚、连翘苷和红景天苷与内标峰面积之比，由标准曲线方程求得血浆中各成分的浓度，获得血药浓度-时间曲线。药代动力学数据处理采用DAS3.0软件。
　　结果：大鼠灌胃给予连花清瘟后，血浆中大黄酸、大黄酚、连翘苷、红景天苷的Cmax分别为：1.813、0.336、0.622、0.579μg/mL；Tmax分别为：1.6、2.3、1.0、2.4h；t1/2分别为：2.213、3.165、1.512、4.13h；AUC0-t分别为：4.36、1.54、1.106、3.229μg/mL·h2；AUC0-∞分别为：4.843、1.74、1.202、4.313μg/mL·h2；MRT分别为：3.152、3.37、1.574、4.233h。
　　结论：首次对连花清瘟胶囊中大黄酸、大黄酚、连翘苷和红景天苷的药代动力学特征及药效物质基础进行研究，为进一步研究连花清瘟胶囊药理药效提供依据。
　　第三部分基于UPLC-Q-TOF-MS技术的连翘苷在大鼠胆汁、尿液及粪便中的代谢研究
　　目的：建立大鼠体内胆汁、尿液中连翘苷定性分析的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法，研究大鼠灌胃给予连翘苷后，连翘苷在大鼠体内的代谢转化，并鉴定其相应的代谢产物。
　　方法：大鼠以10mg·kg-1剂量灌胃给予连翘苷混悬溶液，生物样品采用液液萃取法加入2倍量（v/v）乙酸乙酯萃取3次。Phenomenex Kinetex C18色谱柱（100×2.1mm，2.6μm），流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱，0~1 min，A5%，1~10 min，A5-50%，10~11 min，A50%~70%，11~15 min，A70%-100%，15~15.5 min，A100%-5%，15.5~18 min，A5%。流速为400μL/min，柱温50℃。电喷雾离子源（ESI源），正离子和负离子模式。参数设置为：喷雾电压为（+）5.5kV，（-）4.5kV；离子源温度为550℃；气帘气为25psi；雾化气（gas1）和加热气（gas2）均为55Psi；母离子扫描范围m/z100-1200（滞留时间250ms），子离子扫描范围m/z50-1200（滞留时间100ms）；CE分别为（+）45eV和（-）45eV；CES为15eV；DP分别为（+）60eV和（-）60eV。连翘苷及其代谢物通过智能信息关联采集（IDA）的采集方法，实时动态背景扣除（DBS）以及多重质量亏损（MMDF）触发 TOF-MS/MS，结合 MetabolitePilotTM代谢物鉴定软件进行鉴定。
　　结果：采用 UPLC-Q-TOF-MS法对大鼠体内胆汁、尿液中连翘苷及其代谢物进行定性分析，大鼠灌胃给予连翘苷后胆汁、尿液和粪便中共发现34个代谢物，包括30个I相代谢物和4个II相代谢物，其中28个为新的代谢物。UPLC-Q-TOF-MS方法分析大鼠胆汁样品发现连翘苷可转化为主要代谢物M26，即经脱葡萄糖基团、脱水（-H2O）。
　　结论：本实验首次采用 UPLC-Q-TOF-MS法对连翘苷在大鼠体内代谢途径进行研究，连翘苷主要的生物转化路径为水解、氧化和硫酸化。葡萄糖基团、甲基基团和四氢呋喃环是主要的代谢位点。这些发现提高了对连翘苷代谢及有效形式的认识。
　　第四部分连花清瘟胶囊中指标性成分连翘苷体外代谢种属差异研究
　　目的：采用 UPLC-Q-TOF-MS对大鼠和人肝微粒体体外温孵样品进行分析，初步探究连翘苷体外代谢种属差异特征，并比较体内与体外代谢的异同。
　　方法：采用NADPH-生成系统（由β-NADP、G-6-P、G-6-PD、MgCl2组成），0.1moL/LK2HPO4缓冲液（pH7.4），肝微粒体蛋白1mg/mL，终体积为1mL。将连翘苷与大鼠、人肝微粒体进行体外温孵，使底物浓度为25μg/mL，甲醇终浓度为0.5%，温孵液37℃预热5min后，向反应体系中加入NADPH还原系统启动反应。37℃恒温振荡（150r/min）1h，将反应体系取出，立即放入-20℃冰箱终止反应，每个样品平行温孵3次。样品处理采用液液萃取法，分别加入乙酸乙酯3mL萃取两次。合并有机相40℃N2吹干，残留物用甲醇200μL超声5min复溶后离心（14000r/min）10 min，进样分析。应用UPLC-Q-TOF-MS技术对生物样品进行分析，结合前期体内研究中已经进行结构确证的代谢产物，通过比较保留时间和二级质谱碎片信息推测所测得代谢产物的结构。
　　结果：通过与空白样品比较，在大鼠、人肝微粒体检测并鉴定了16个不同结构代谢物。检测到6个代谢物与大鼠胆汁中检测到的代谢物一致，其余10个为体外发现新的代谢物。连翘苷大鼠、人肝微粒体温孵样品代谢途径主要包括水解、氧化、脱甲基反应。相似性指数（SI=0.952）表明连翘苷在大鼠和人肝微粒体中代谢非常相似。结果表明UPLC-Q-TOF-MS法结合累积分布函数（CDF）是评价连翘苷代谢种属差异有效的方法。
　　结论：连翘苷体外肝微粒代谢研究表明两个种属的Ⅰ相代谢产物相似，大鼠与人几乎无种属差异。本研究提供了连翘苷全面的体内和体外代谢谱，并可用于预测人体代谢研究。
　　第五部分基于 UPLC-MS-MS技术的连花清瘟胶囊在大鼠体内的排泄研究
　　目的：建立大鼠胆汁、尿液中大黄酚、大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、甘草苷、连翘苷、木犀草素、红景天苷定量分析的UPLC-MS-MS方法，研究经胆汁和尿液排泄动力学过程，探讨其在大鼠体内的排泄动力学规律，为连花清瘟胶囊的研发和药物临床应用的安全性提供依据。
　　方法：大鼠2%戊巴比妥钠麻醉后行胆管插管术，待动物完全清醒后给予连花清瘟混悬液。分别于0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-24、24-36h收集胆汁样品。大鼠给药后0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-36h收集尿液样品。样品预处理采用一步沉淀蛋白法。采用 Waters ACQUITY UPLC? HSS T3 C18色谱柱（2.1×50 mm,1.8μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脱，0~2.5 min，A15%-85%，2.5~4.5 min，A85%~15%，4.5~7.5min，A15%，流速为400μL/min，电喷雾离子源（ESI源），正/负离子模式。
　　结果：采用ESI离子源，MRM正/负离子切换扫描模式完成检测和定量分析。对定量方法进行优化整个运行时间为7.5min。完整的定量方法学验证显示方法的线性和专属性良好。方法学验证结果显示该方法简单、快速、专属性强。大鼠灌胃给予连花清瘟混悬液后8个待测化合物均可在大鼠尿液中检测到，胆汁中可检测到5个待测化合物。8个待测物在尿液中12h内累计排泄量达到最大值，之后趋于恒定。大黄酸、大黄酚和芦荟大黄素尿液排泄率分别为78.0%、43.9%和37.0%，证实尿液为主要的排泄消除途径。连翘苷、甘草苷、大黄素、木犀草素和红景天苷尿液排泄率较低，可能存在其他消除途径或广泛代谢消除。大黄酸、大黄酚、大黄素、连翘苷和红景天苷胆汁排泄均较低，小于4.25%。
　　结论：所建立的方法可用于大鼠给予连花清瘟胶囊后8种主要成分在大鼠尿液排泄研究，连花清瘟胶囊的药效物质基础研究为其药理机制研究提供依据。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

英文缩写

引言

第一部分基于UPLC-MS-MS技术的连花清瘟胶囊多组分同时分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分基于UPLC-Q-TOF-MS技术的连花清瘟胶囊在大鼠体内的药动力学特征

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分基于UPLC-Q-TOF-MS技术的连翘苷在大鼠胆汁、尿液及粪便中的代谢研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分连花清瘟胶囊中指标性成分连翘苷体外代谢种属差异研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分基于UPLC-MS-MS技术的连花清瘟胶囊在大鼠体内的排泄研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述: HPLC-MS/MS在药物代谢和药代动力学筛选中的应用

致谢

个人简历