光动力联合化疗对食管癌的临床疗效与体外作用机制的研究

摘要

食管癌的发病率占全世界恶性肿瘤发病率的第九位，高发区包括亚洲，而全世界一半的食管癌发生在我国，且我国的食管癌97.6％为鳞状细胞癌。食管癌各期的治疗手段各异，手术是早期食管癌的首要治疗手段，但是术后复发率很高，而且50％的患者在诊断时已为晚期，失去了手术机会，甚至部分患者一般身体状况差，难以耐受手术。化疗也是食管癌的重要治疗手段之一，但却面临着多药耐药性及副作用大的问题。近年来发展的光动力治疗是一种新的食管癌局部治疗手段，具有明显的改善患者局部吞咽困难症状、改善患者生活质量及延长生存期等优势，并且具有创伤性小、选择性好、副作用小、不影响器官功能等优点，对于身体机能评分较低的患者、姑息性治疗的晚期患者以及原位癌的患者等都具有适应症[1]，国内外许多研究证明食管癌的光动力治疗能够取得明显的近期疗效。对于体积小的早期食管癌，光动力可以达到根治肿瘤的目的，但对于体积较大的中晚期食管癌，单靠光动力治疗难以治愈，因此光动力治疗与传统的全身治疗手段一化疗结合有望取得更好的疗效。 目前，可用于肿瘤光动力治疗的光敏剂主要有血卟啉衍生物、氨基乙酰基丙酸、二氢卟吩、金属钛菁、苯并卟啉衍生物、德赛卟啉等类化合物。血卟啉类光敏剂是开发最早、上市最早的肿瘤光动力治疗药物。其中，加拿大AXCAN公司出品的Photofrin(porfimersodium)从1996年起先后获FDA批准用于多种肿瘤和伴重度异型增生(HGD)的食管Barrett病变(BE)的治疗，目前已在十几个国家注册上市，该药是低聚卟啉的混合物。其在肿瘤的诊断和治疗中都取得了肯本课题初步探讨了常用光敏剂-血卟啉衍生物介导的光动力治疗联合化疗这种新的综合模式，在食管癌治疗中的优势，并从细胞和分子水平研究其可能发生的机制，第一部分通过回顾性分析比较我院中晚期食管癌光动力局部治疗与光动力联合化疗两种治疗模式的疗效差别，了解光动力联合化疗对食管癌临床疗效的优势；第二部分通过体外实验了解光动力联合化疗对食管癌细胞株Eca-109增殖的影响并探讨其发生的机理，从而为临床食管癌的综合治疗各参数的选择提供参考。 第一章中晚期食管癌光动力治疗联合化疗的回顾性研究 目的：比较中晚期食管癌的单纯光动力治疗与光动力联合化疗的疗效，探讨中晚期食管癌光动力联合化疗的治疗模式的优势。 方法：回顾性分析我院自2002年至2005年期间60例光动力治疗的食管癌患者，TNM分期均为Ⅲ～Ⅳ期，其中单纯光动力治疗27例(A组)，光动力联合化疗治疗33例(B组)。光动力治疗使用光敏剂Photofrin2mg/kg，注射光敏剂后48h在内镜引导下，使用波长为630nm的激光照射，综合治疗组化疗方案为氟尿嘧啶(5-FU)联合顺铂(DDP)，在光动力治疗后1周开始化疗，共4个周期。 结果：60例病人随访时间为2月～56月，中位随访时间为16.7月。单纯光动力治疗组和综合治疗组症状缓解率分别为85.2％、93.9％，内镜评价有效率分别为85.2％、90.9％，差异无显著性意义。A组与B组中Ⅲ期患者的中位生存时间分别为17月及33月，经Log-Rank检验，差异尚无统计学意义(P=0.076)：而Ⅳ期患者的中位生存时间分别为3月及8月，经Log-Rank检验有显著性差异(P=0.001)。2年内的生存状况多因素COX回归分析显示组别、分期是影响患者生存(远期疗效)的因素，综合治疗组的疗效好，Ⅳ期患者发生死亡的风险是Ⅲ期患者的7.894倍。临床常用的2年生存率这个指标，A、B两组患者分别为26％和42％。 结论：光动力联合化疗治疗中晚期食管癌优于单纯光动力治疗，短期疗效相当，2年生存期有优势。 第二章光动力联合化疗对食管癌细胞株Eca-109增殖的影响及机理探讨 目的：研究光动力联合氟尿嘧啶和顺铂化疗药物对食管癌细胞株Eca-109增殖的抑制作用，和初步机理探讨。 方法：将食管癌细胞株Eca-109分为6组，A：对照组，B：化疗组，C：化疗+高剂量光敏剂治疗组，D：化疗+低剂量光敏剂治疗组，E：高剂量光敏剂治疗组，F：低剂量光敏剂治疗组。种板孵育24h后，采用台盼蓝染色法检测肿瘤细胞的存活率；于化疗组加入化疗药(5-Fu+DDP)作用12h，再按实验分组加入光敏剂血卟啉衍生物(HPD)低剂量或高剂量，4h后行630nm激光照射，光能量密度30J/cm2，照射前后各组细胞在倒置显微镜和荧光显微镜下观察细胞形态和荧光强度；照光后继续培育24h，开始行MTT法检测食管癌细胞增殖的抑制率；AnnexinV-PI双染结合流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率；Westernblot检测凋亡相关基因蛋白Bcl-2的表达水平。 结果： 1.细胞形态学观察结果 倒置显微镜下，所有加光敏剂实验组细胞光照1h后：各实验组细胞均有不同程度的形态变化，细胞变圆，体积缩小，但细胞膜结构完整。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。至4h细胞形态变化更明显，发生形态变化的细胞数量增多。高剂量光敏剂光动力+化疗组细胞异常更多见，细胞数明显减少。而对照组细胞贴壁状态良好，呈多边形细胞，体积较大，胞浆丰满，细胞边界清楚。 2.照光前后细胞荧光强度变化 荧光镜下可见：所有加光敏剂实验组细胞均有荧光显示，光敏剂浓度越高，细胞的荧光显示越强；光动力组细胞光照后较光照前细胞荧光明显减弱。而未加光敏剂实验组细胞无荧光显示。 3.MTT法测细胞生长抑制率 各组间方差不齐，采用完全随机设计下的近似方差分析，结果显示组问差异有显著性意义(P=140.674，P=0.000)，用Games-Howell进行组间多重比较，结果显示除了低剂量光敏剂+化疗组同高剂量光敏剂组差异不显著外，其余相互间差异均有显著性意义，高剂量光敏剂+化疗组细胞抑制率较高，低剂量光动力组抑制率较低。 4.流式细胞仪检测凋亡用 完全随机设计下的方差分析，结果显示A～F组间差异有显著性意义(F=481.588，P=0.000)，用LSD进行组间多重比较，结果显示除了化疗组同高剂量光敏剂组差异不显著外，其余相互间差异均有显著性意义，高剂量光敏剂+化疗组凋亡率较高，而阴性对照组最低。 5.Westernblot法检测Bcl-2蛋白的结果 蛋白电泳图谱显示：高剂量光敏剂+化疗组颜色较浅，对照组色泽较深。实验组色泽均比空白对照组不同程度变浅。 结论： 1.在特定光源状态下，一定的光敏剂、光照能量密度、孵育时间，光敏剂孵育浓度是人食管癌细胞Eca-109体外光动力效应的主要影响因素。两种不同的HPD孵育浓度下细胞抑制率有显著性差异。相同光照能量密度及孵育时间下，孵育浓度越高，其杀伤效应越强。 2.光动力与化疗联合对食管癌细胞的杀伤力提高，且肿瘤细胞的凋亡率增加，Bcl-2凋亡蛋白表达下降，说明光动力与化疗均能通过抑制Bcl-2表达途径，促进肿瘤细胞凋亡，且光动力与化疗有协同作用。 3.HPD光敏剂能很好地被410-450nm波长的蓝光激发，显示荧光效应，HPD浓度越高，食管癌细胞摄取的光敏剂越多，细胞显示的荧光强度越强，且同等浓度的光敏剂浓度，荧光强弱与细胞的活性成正比，HPD光敏剂可用于荧光诊断。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略语对照表

声明

前言

第一章 中晚期食管癌光动力治疗联合化疗的回顾性研究

1.1材料与方法

1.2 结果

1.3讨论

第二章光动力联合化疗对食管癌细胞株Eca-109增殖的影响及机理探讨

2.1材料与方法

2.2结果

2.3结论

2.4讨论

全文总结

参考文献

照片

学习期间发表的论文及成果

致谢