肝螺杆菌的分离鉴定及其与肠道炎症性疾病的相关性研究

摘要

研究背景/目的： 螺杆菌是一类微需氧条件生长，营养要求高的革兰染色阴性螺旋状细菌，主要定植在宿主胃肠道微环境，肝胆系统，引起组织炎症，甚至肿瘤发生。近年来，随着越来越多的螺杆菌成员不断从人，动物的胃，肝肠组织中被分离发现，除了以幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)为代表的胃内螺杆菌与人胃炎，胃十二指肠溃疡，胃癌，胃粘膜相关淋巴组织(mucosa-associatedlymphoidtissue，MALT)淋巴瘤发生相关已得普遍认同外，肝肠螺杆菌(enterohepatichelicobacterspecies，EHS)的研究也引起国内外学者的日益关注，虽然动物是大部分螺杆菌的自然宿主，然而实验表明EHS感染不同品系免疫缺陷动物可引发宿主不同程度的免疫反应从而导致肝胆道炎，盲结肠炎，甚至肿瘤的发生，其中肝螺杆菌(Helicobacterhepaticus，H.hepatitus)是目前研究较多的EHS，也是又一明确证实的致癌原。此外，随着国外陆续报道从人体内分离培养及检测到EHS感染，因此EHS与人肝肠疾病的发生是否有着直接或间接的致病作用逐渐成为新的研究方向。而我国在EHS方面的研究还尚未开展，本课题旨在从初步研究了解H.hepaticus开始，率先开展EHS的国内研究，可能为人类炎症性疾病的病因学提供依据。 方法： 1.肝螺杆菌的分离、培养、鉴定及致病性评价 从实验室常用Balb/c小鼠肠粘膜分离培养H.hepaticus，通过Gram's染色，生化，电镜下形态，基因测序鉴定；体外细胞毒实验，H.hepaticus超声裂解物与大肠癌细胞LoVo共同培养，倒置显微镜观察72h并通过cck-8检测不同浓度H.hepaticus裂解液对大肠癌细胞LoVo的细胞增殖影响，流式细胞仪检测细胞周期变化，Hoechst荧光染色观察细胞核形态特点。 2.肠粘膜炎症与螺杆菌感染的相关性调查 通过肠粘膜细菌培养和聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)检测螺杆菌特异性16SrRNA基因初步检测我国肠道炎症性疾病和正常人群肠道中螺杆菌感染情况。 结果： 1.肝螺杆菌的分离、培养、鉴定及致病性评价 Gram's染色，生化，电镜下形态，基因测序鉴定成功分离培养出我国首株H.hepaticus，与国外报道不同，该株H.hepaticus硝酸还原试验阴性；H.hepaticus裂解液与大肠癌细胞LoVo共同培养，随着培养时间延长①能引起大肠癌细胞LoVo形态改变，贴壁生长的多形细胞减少，圆形，悬浮细胞及细胞碎片增多，②Hoechst染色观察胞核固缩或胀大，核碎裂，凋亡小体形成，③G2/M期阻滞细胞比率增加，④随着裂解液浓度增加对细胞的杀伤率随之升高(P=0.000)。 2.肠粘膜炎症与螺杆菌感染的相关性调查 本次实验并未从肠粘膜中分离培养出螺杆菌，肠粘膜螺杆菌16SrRNA基因检出率，炎症性肠病组(inflammatoryboweldisease，IBD)46.2％(6/13)，非特异性肠炎组检出率47.2％(17/36)，肿瘤组57.1％(3/7)，对照组9.1％(2/22)，差异有显著意义(x2=10.629，P=0.014)，20例PCR产物的测序结果与H.pylori同源性99％。 结论： 螺杆菌与人类肝肠疾病的相关性是当今研究的新方向，本文从动物中分离出一株硝酸还原阴性的H.hepaticus填补国内EHS培养空白，该株H.hepaticus对大肠癌细胞LoVo具有明显的体外细胞毒作用，其毒性与培养时间，菌液浓度呈正相关性；肠粘膜螺杆菌感染检出率46.2％～48.2％。短片断16SrRNA基因测序本次实验并未发现其他EHS感染均为H.pylori，但由于EHS还可在人畜共同传播感染不排除接触感染导致人类疾病的发生，因此，有进一步扩大样本量改进研究方法深入调查的必要。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分肝螺杆菌分离鉴定及其体外细胞毒性试验

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分螺杆菌感染与肠粘膜炎症的相关性研究

引言

材料与方法

结果

讨论部分

全文小结

参考文献

在读期间撰写论文情况

附录

感谢