定心方对ApoE基因敲除小鼠动脉粥样硬化及内脏脂肪素表达的研究

摘要

一、背景
　　 自20世纪80年代以来，随着我国人民物质生活水平的提高，生活方式的改变，随着中国人口正在逐步迈入老龄化进程，加上肥胖人群及代谢综合征发病率的增高，冠心病已成为我国最常见的心血管病病种，成为危害我国人民健康的严重公共卫生问题。冠心病的主要病理基础是由血细胞、紊乱血流和血管壁之间的动态相互作用结果形成的动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)，而AS的具体发病机制至今尚未明确，研究者们先后提出脂质浸润学说、动脉平滑肌细胞增殖学说、受体缺失学说、血栓源性学说、损伤反应学说等假说，随着对动脉粥样硬化研究的不断深入，人们逐渐认识到炎症是AS发生发展过程中的重要因素。早在上世纪末Ross就提出AS是一种炎症性疾病，越来越多的研究证实炎症反应在AS的发生发展中起着重要的作用，并且贯穿于AS斑块的形成、生长到最后斑块表面破裂并发血栓形成的所有阶段。AS斑块内的炎症反应促使不稳定斑块的形成和破裂，并在此基础上发生细胞成分的活化并介导血栓形成，是大多数急性冠脉综合征发生的中心启动环节。AS代表了慢性炎症过程，系统性抑制炎症过程可能是治疗冠心病的关键。
　　 内脏脂肪素(Visfatin)是一种近几年新发现与炎症和代谢综合征有关的脂肪组织分泌的细胞因子， Visfatin与以往在淋巴细胞中发现的一种称为“前B细胞集落增强因子”(pre-B cell colony-enhancing factor，PBEF)的免疫系统蛋白为同一物质。Visfatin具有多种生物学活性，如模拟胰岛素样活性、增加胰岛素敏感性、参与炎症反应应答、诱导血管生成、延缓中性粒细胞凋亡、调节脂代谢等。虽然目前Visfatin在体内的具体作用及作用机理尚未深入研究，但它的发现为研究糖尿病、代谢综合征、心血管疾病等相关疾病的发病机制、早期诊断及治疗提供了新的思路。
　　 研究发现血浆Visfatin水平与血管内皮细胞功能在2型糖尿病患者中呈显著负相关，而血管内皮损伤是AS发生的起始环节之一。血浆Visfatin在代谢综合征患者中显著升高，而在伴有颈动脉粥样硬化的患者其升高更为明显。Visfatin在不伴有肥胖、糖尿病等代谢性疾病的冠心病患者中，水平同样也升高。冠心病患者的血浆Visfatin水平显著升高，特别是急性冠脉综合症患者升高更为明显，Visfatin是独立于既往已知冠心病危险因素的又一新的危险因素。通过病例对照研究得到了相同的结论，病例组的血浆Visfatin浓度显著高于对照组，并且Visfatin与高敏C反应蛋白(high sensitivity C-reactive protein，hs-CRP)呈显著正相关，多元回归分析证实血浆Visfatin是心肌缺血性发作的独立危险因素。有临床研究显示，冠心病患者血浆的Visfatin的升高伴有单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、hs-CRP等炎症介质的升高，进行体外细胞水平实验得到类似的结论。此外，Visfatin可以增强单核细胞株中单核细胞基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)及外周血单核细胞中肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-alpha，TNF-α)、白介素-8(interleukin-8，IL-8)的表达。以上研究表明，Visfatin可能在AS炎症反应过程中扮演了重要角色。
　　 C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)是各种急性组织损伤、感染及其他各种炎症刺激的急性期反应蛋白，不稳定心绞痛患者可通过检测血浆CRP浓度判断愈后。通过检测不稳定型心绞痛病人血浆CRP，结果显示CRP＞3μg/ml的患者存活率显著低于CRP＜3μg/ml的患者。对于稳定型心绞痛病人，经行冠状动脉支架植入术72小时后测量血浆CRP水平，并开展持续1年的随访检测，结果显示CRP＜5μg/ml的患者存活率明显高于CRP＞5μg/ml的患者。始于上世纪末的“医师健康研究”是一项具有里程碑意义前瞻性研究成果，它主要通过检测健康个体中CRP浓度预测未来心血管疾病事件发生的危险性。该项实验通过检测1086名成年健康男性的基础CRP水平，并开展持续8年的随访监测，其中CRP水平较高543名男性后来发展为心肌梗塞、中风及静脉栓塞等心血管疾病，另543名男性没有心血管疾病事件的报告。此后对绝经期妇女进行了前瞻性研究，同时比较了其它的炎症标志物，如血清淀粉样P成分(serum amyloidPcomponent，SAP)、白介素-26(interleukin-26，IL-26)、细胞间黏附分子-21(intercellular adhesion molecule-21，sICAM21)等，发现CRP是最强有力的心血管病危险的预示标志物。近年来CRP已被作为一种冠心病的独立预测指标，美国心脏病协会达成以CRP作为测定心血管疾病危险性指标的共识。
　　 TNF-α是炎症因子家族中较活跃，并较容易在外周循环中测得的细胞因子，具有多种生物学效应，主要参与炎症反应的级联过程。TNF-α可以通过直接介导T淋巴细胞粘附、迁移，并积聚在受累内皮下，形成内皮功能障碍，促进血管平滑肌细胞的增殖，使内皮正常平衡调节作用改变。TNF-α也能诱导血小板黏附，增强白细胞的趋化作用，促进凝血、抑制纤溶、促进单核细胞对内皮细胞的粘附以及降低血管平滑肌细胞活性等作用，持续炎症反应过程，刺激平滑肌迁移和炎症细胞交织，形成AS斑块。同时TNF-α能抑制血管平滑肌细胞表达间质基因，是纤维帽变薄弱和平滑肌增生能力降低增加斑块的易损性。在急性冠脉综合症患者的抗炎治疗中发现抗炎药物都可以降低TNF-α的水平，血浆TNF-α水平与早期动脉粥样硬化的程度相关，提示TNF-α产生增加是动脉粥样硬化形成的一种早期而且重要的事件，人们认为炎性细胞因子TNF-α可作为将来心血管事件发生的危险因素和预测因子。
　　 中医药防治冠心病疗效确切，中医药对抗动脉粥样硬化的作用机制具有多层次、多角度、多靶点的特征，其中抗炎是重要的机制之一。很多中医学者认为，从中医病因病机理论角度来看，AS具有“气虚、血瘀、痰湿”的特点，益气活血祛痰应是中医药防治AS主要方法之一。定心方是我校附属南方医院中医内科经验方，由丹参、三七、赤芍、瓜蒌、茯苓、党参、灵芝、酸枣仁、苦参、黄连等组成，具有益气活血祛痰燥湿之功效，临床研究证明其对冠心病有良好的疗效。前期实验表明，定心方对缺血及再灌注损伤有良好的保护作用，其作用机制与降低核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）、TNF-α、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)等炎症介质有关。
　　 二、目的
　　 本实验采用ApoE基因敲除小鼠加上高脂饲料喂养复制AS动物模型，用定心方对ApoE基因敲除小鼠AS模型进行干预，监测在AS发展过程中Visfatin在血清和组织的蛋白表达，以了解Visfatin在AS中的作用。观察定心方对AS斑块的影响和对Visfatin及炎症因子CRP、TNF-α表达的干预作用，为AS的预防和治疗提供新的思路。
　　 三、方法
　　 8周龄C57BL/6J背景的雄性ApoE-/-小鼠，适应性喂养7天，随机分为5组，每组7只。分别为模型组，辛伐他汀组，定心方低剂量组，定心方中剂量组，定心方高剂量组，并以7只8周龄雄性C57BL/6J小鼠作为空白对照组，所有小鼠均高脂饲料喂养。定心方低剂量组定心方药液灌胃9.30g/kg，每日一次;定心方中剂量组定心方药液灌胃18.59 g/kg，每日一次;定心方高剂量组定心方药液灌胃37.18 g/kg，每日一次;辛伐他汀组辛伐他汀药液灌胃5 mg/kg，每日一次，其他组给予等剂量生理盐水灌胃。各组小鼠自由饮水，根据小鼠体质量（每周测量1次），以校正给药量，12周后停止药物干预，结束实验。
　　 腹腔麻醉小鼠，眼球摘除法获得血液标本，行心脏灌注，自主动脉根部至腹主动脉末端分离整条主动脉，一部分放入4％多聚甲醛中固定，一部分放入液氮中保存。
　　 主动脉组织常规石蜡包埋、切片，常规HE染色观察主动脉组织病理学改变，计算各组斑块面积百分比。分离的血清，检测总胆固醇(total cholesterol，TC)、甘油三脂(triglycerides，TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)含量。采用双抗体夹心ELISA法检测血清中Visfatin、CRP、TNF-α的表达，观察定心方对ApoE-/-小鼠AS模型中血清Visfatin、CRP、TNF-α的影响。主动脉组织提取蛋白，进行蛋白印迹实验，观察Visfatin表达的变化及定心方对其表达的影响。
　　 实验数据属于完全随机设计的计量资料，故采用单因素方差one-wayANOVA进行方差分析，方差齐时采用LSD法进行组间多重比较，方差不齐时采用Dunnett's T3法进行组间多重比较，实验数据以x±s表示，变量间的相关的因素采用逐步多元直线回归分析，P＜0.05为有显著性差异。采用SPSS13.0软件进行数据的统计学分析。
　　 四、结果
　　 1.定心方对ApoE-/-小鼠体重及生长情况的影响实验结束后称量体重，各组小鼠实验结束时体重均有一定的增加。空白对照组、模型组、辛伐他汀组、定心方低剂量组、定心方中剂量组、定心方高剂量组体重增加值分别为(3.83±0.93)g、(7.70±1.01)g、(6.87±0.82)g、(4.97±0.58)g、(4.87±0.70)g、(4.61±0.49)g，各间组小鼠体重增加值有显著差异（F=25.379，P=0.000）。各给药组体重增加值均低于模型组，其中定心方低剂量组、定心方中剂量组、定心方高剂量组体重增加值与模型组比较有统计学意义（P＜0.01）;定心方高剂量组与定心方中剂量组、定心方低剂量组体重增加值无显著差异（P＞0.05）;辛伐他汀组体重增加值与模型组相比无显著性差异(P=0.054)。对各组小鼠的摄食情况观察表明，各组小鼠摄食和饮水均正常。模型组小鼠毛色普遍缺乏光泽度，活动较差，排泄尚正常。辛伐他汀组、定心方低剂量组、定心方中剂量组、定心方高剂量小鼠的生长情况较模型组有所改善。
　　 2.各组小鼠血脂各项指标的变化对各组小鼠血清脂质水平测定表明，模型组血脂水平显著高于空白对照组（P＜0.01），各给药组血清TC、TG、HDL、LDL水平均低于模型组。与模型组相比，定心方高剂量组、辛伐他汀组血清TC、TG、HDL、LDL显著降低(P＜0.05)，两组组间比较比较无显著差异（P＞0.05）。定心方高剂量组血脂水平低于定心方低、中剂量组，其中TG水平显著降低(P＜0.01)。
　　 3.定心方对ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块病变病理观察病理观察可见空白对照组主动脉内膜光滑完整，主动脉壁厚薄均匀，内膜、中膜及外膜结构清晰，未见脂质条纹或纤维斑块。模型组主动脉管壁厚薄不均，可见大量充满脂质的泡沫细胞及胆固醇结晶裂隙的粥样斑块病灶，斑块体积较大，其中脂质核心较大，融合成片，内膜广泛而明显的纤维化、增厚，血管壁向管腔内突出，中膜平滑肌明显萎缩变薄，外膜可见结缔组织增生及炎细胞、浆细胞浸润，血管内弹力膜围绕面积明显比空白对照组增大。各给药组间小鼠主动脉根部粥样斑块面积百分比有显著差异（F=290.316，P=0.000）。与模型组比较，各给药组小鼠主动脉根部AS病变得以不同程度的控制，其中定心方低剂量组小鼠主动脉根部斑块内的脂质中心面积相对变小，纤维帽较厚;辛伐他汀、定心方中剂量组、定心方高剂量组小鼠主动脉根部斑块面积百分比明显减小。模型组与辛伐他汀组、定心方中剂量组、定心方高剂量组小鼠主动脉根部粥样斑块面积百分比差异有统计学意义（P＜0.01）;定心方低剂量组与模型组主动脉根部动脉粥样斑块面积百分比之间差异无统计学意义(P=0.849);定心方高剂量组与定心方中剂量组主动脉根部动脉粥样斑块面积百分比差异具有统计学意义（P=0.000）;定心方高剂量组与辛伐他汀组主动脉根部动脉粥样斑块面积百分比差异无统计学意义(P=1.000)。定心方各给药组从对AS病变的抑制效果呈量效关系。
　　 4.定心方对ApoE-/-小鼠血清CRP水平的影响各组间小鼠血清CRP水平有显著差异（F=238.171，P=0.000）。与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠血清CRP水平明显增高(P=0.000)。辛伐他汀组、定心方低剂量组、定心方中剂量组、定心方高剂量组小鼠血清CRP水平显著低于模型组小鼠(P＜0.01)。定心方高剂量组CRP水平低于定心方低剂量组、定心方中剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）;定心方高剂量组小鼠血清CRP水平低于辛伐他汀组，经统计学处理两组间差异无显著性(P=0.635)。
　　 5.定心方对ApoE-/-小鼠血清TNF-α水平的影响各组间小鼠血清TNF-α水平有显著差异（F=288.101，P=0.000）。与空白对照组小鼠相比，模型组小鼠血清TNF-α水平明显增高(=0.000)。辛伐他汀组、定心方低剂量组、定心方中剂量组、定心方高剂量组小鼠血清TNF-α水平显著低于模型组小鼠(P＜0.01)。定心方高剂量组TNF-α水平低于定心方低剂量组、定心方中剂量组，差异具有统计学意义（P＜0.05）;定心方高剂量组小鼠血清TNF-α水平高于辛伐他汀组，经统计学处理两组间差异无显著性(P=0.998)。
　　 6.Western blot检测各组ApoE-/-小鼠主动脉组织中Visfatin蛋白表达通过分析结果中目的条带图像发现，各组间主动脉组织中Visfatin蛋白的表达有显著性差异（F=201.400，P=0.000）。与空白组相比，模型组主动脉组织Visfatin的表达较空白对照组显著升高，差异有统计学意义（p=0.000）;辛伐他汀组、定心方中剂量组、定心方高剂量组主动脉组织Visfatin水平与模型组相比有所降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）;定心方高剂量组Visfatin水平低于定心方低剂量组、定心方中剂量组（P＜0.05）），差异具有统计学意义;辛伐他汀组与定心方高剂量组主动脉组织Visfatin的表达差异无统计学意义（P=0.869）。
　　 7.定心方对ApoE-/-小鼠血清Visfatin水平的影响检测ApoE-/-小鼠血清中Visfatin水平，各组差异具有统计学意义（F=373.845，P=0.000）。模型组小鼠血清Visfatin含量较空白对照组显著升高，差异有统计学意义(P=0.000);辛伐他汀组、定心方中剂量组、定心方高剂量组小鼠血清Visfatin含量低于模型组(P＜0.01)，差异具有统计学意义;定心方高剂量组血清Visfatin水平低于定心方低剂量组、定心方中剂量组（P＜0.01），差异具有统计学意义;定心方高剂量组与辛伐他汀组小鼠血清Visfatin含量差异无统计学意义（P=0.793）。
　　 8.ApoE-/-小鼠血清和组织Visfatin表达与血清CRP、TNF-α水平的相关性分析逐步多元直线回归分析显示ApoE-/-小鼠血清Visfatin水平与血清CRP水平呈正相关关系，相关关系具有统计学意义（R2=0.893，F=334.545，p=0.000）;血清Visfatin水平与血清TNF-α水平的相关关系不具有统计学意义（P=0.174）。ApoE-/-小鼠主动脉组织Visfatin表达与血清TNF-α水平呈正相关关系，相关关系具有统计学意义（R2=0.856，F=95.352，P=0.000）;主动脉组织Visfatin表达与血清与血清CRP水平的相关关系不具有统计学意义（p=0.181）。
　　 五、结论
　　 1.不同剂量定心方均可减轻ApoE-/-小鼠主动脉病理病变，定心方高剂量组管腔狭窄程度明显减轻，斑块较小，优于辛伐他汀组。
　　 2.不同剂量定心方均可明显减轻AS病程中ApoE-/-小鼠体重增加值，定心方给药组ApoE-/-小鼠血脂水平显著下降，说明定心方对ApoE基因缺陷小鼠有降脂和减肥作用，延缓了AS进展。
　　 3.模型组小鼠血清CRP、TNF-α水平、血脂水平较空白对照组小鼠明显增高，而高剂量定心方治疗后血清CRP、TNF-α水平及血脂水平显著下降，并显示出比对照药辛伐他汀更为突出的效果，证实了定心方对AS的抑制作用，定心方可能通过减轻ApoE-/-小鼠炎症反应而起到抗AS及稳定斑块的作用。
　　 4.Visfatin在模型组小鼠血清和组织中高表达，进一步证实了Visfatin与AS之间存在明确的相关性，其可能参与了AS的发生发展。ApoE-/-小鼠的血清中的Visfatin与血清CRP存在显著正相关关系，主动脉组织中的Visfatin与血清TNF-α水平存在显著正相关关系，提示Visfatin参与炎症应答。
　　 5.中、高剂量定心方治疗降低ApoE-/-小鼠血清和组织中的Visfatin的表达，提示定心方对ApoE-/-小鼠AS的抑制作用与降低Visfatin表达水平相关。

目录

摘要

前言

第一章 定心方对ApoE基因敲除小鼠AS模型体重和血脂水平的影响

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

参考文献

第二章 定心方对ApoE基因敲除小鼠AS模型主动脉粥样硬化斑块病理及炎症反应影响

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

参考文献

第三章 定心方对ApoE基因敲除小鼠内脏脂肪素表达影响

一 材料与方法

二 结果

三 讨论

参考文献

全文总结

附录一：缩略词

附录二：附图

攻读硕士学位期间成果

致谢

声明

统计学证明