三株硫氧化细菌（SOB）的生理生化及系统发育研究

摘要

硫是自然界存在的重要元素之一，在生物地球化学循环中，微生物参与的硫的循环反应是构成大自然能量物质循环的主要途径之一。硫氧化细菌(SOB)可以将单质硫或还原态的硫化合物氧化成硫酸盐，因此在微生物浸矿、微生物脱硫等方面有广阔的的应用前景。从我国广东大宝山铜矿、新疆富蕴铜镍矿、江西永平铜矿的酸矿废水中分离得到三株硫氧化细菌DBS-4、FY-2、YP-5，对其进行形态学观察、生理生化性状分析以及系统发育研究。 通过光学显微镜染色、活体观察及透射电子显微镜的观察发现，这三株硫氧化细菌均为革兰氏阴性菌，杆状(0.5～1.5×0.2～0.4um)、运动、无荚膜、不产孢子；最适生长温度为30℃，三株细菌在pH1.5～6.5均可生长，DBS-4，FY-2，YP-5的最适初始pH分别为5.5、4.5、6.5；可以利用单质硫、硫代硫酸盐、连四硫酸盐生长，而不能单独利用各种有机物和Fe<'2+>作为碳源和能源生长，但同时发现以单质硫作为能源的时，加入0.02﹪的酵母浸膏，可以促进其生长，说明分离得到的三株硫氧化细菌为中度嗜酸的混合营养型细菌。 通过16s rRNA基因序列分析，并构建系统发育进化树，发现它们与几株未鉴定到种的Acidithiobacillus．spp．菌株同源性最高，达到了99﹪以上，与Acidithiobacillus．caldus的同源性分别为 91.9﹪，93.2﹪，90.0﹪，而与 Acidithiobacillus．thiooxidans 和Acidithiobacillus．ferrooxidans 亲缘关系相对较远，同源性都在90﹪以下。综合表型特征及系统学研究结果，说明这三株硫氧化细菌(DBS-4，FY-2，YP-5)均属于嗜酸硫杆菌属Acidithiobacillus。 此外，对三株细菌的金属离子耐受性研究表明，DBS-4对Cu<'2+>和Zn<'2+>的耐受性最强，而对Ni<'2+>最敏感；YP-5对Ni<'2+>的耐受性最强，而对Cu<'2+>最为敏感：三株细菌对Mn<'2+>的耐受性相差不大，在80mM浓度下生长均受到抑制。全细胞蛋白电泳图谱分析表明，三株细菌与At．thiooxidans ATCC 19377<'T>和At．ferrooxidansATCC 23270<'T>的差异明显，而三株细菌间的相似性相对较高。以上结果表明三株细菌由于环境的不同而产生生理和蛋白组成上的差异。 研究表明，分离的三个菌株明显不同于 Acidithiobacillus属已经确认其它三个种。因此需要进行细胞壁成份测定、G+Cmol﹪测定和DNA-DNA同源性杂交以便进一步确定其分类学和系统学地位。

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缩略词表

摘要

第一部分文献综述

1.1硫氧化微生物的代谢类型及物种多样性

1.2 Acidithiobacillus属的分类学及分子系统学研究

1.2.1 Acidithiobacillus ferrooxidans

1.2.2 Acidithiobacillus thiooxidans

1.2.3 Acidithiobacillus caldus

1.2.4 Acidithiobacillus albertensis

1.3硫氧化微生物的硫氧化机制

1.3.1连多硫酸盐途径

1.3.2多酶复合体或SOX途径

1.3.3硫代硫酸盐氧化的支路途径

1.4硫氧化微生物对生态环境的意义及其应用

1.4.1硫氧化微生物对生态环境的意义

1.4.2硫氧化微生物的应用

1.5细菌分类学及系统学研究方法

1.5.1经典分类

1.5.2数值分类

1.5.3化学分类

1.5.4现代分类

1.6立论依据及研究目的

第二部分三株硫氧化细菌(SOB)的生理生化及系统发育研究

2.1实验材料和方法

2.1.1硫氧化细菌的分离、纯化和培养

2.1.2形态学观察

2.1.3生理生化特征分析

2.1.4 16s rRNA基因序列分析

2.1.5.金属耐受性检测

2.1.6全细胞蛋白电泳

2.2结果

2.2.1形态学观察

2.2.2最适初始pH和最适生长温度

2.2.3无机底物的利用

2.2.4有机底物的利用

2.2.5 16s rRNA基因序列分析

2.2.6金属耐受性的测定

2.2.7全细胞蛋白电泳分析

2.3讨论

2.4结论和展望

参考文献

致谢