拟南芥叶肉原生质体分离及瞬时表达体系的建立

摘要

拟南芥作为模式植物在生物学研究中有着十分重要的作用和极大的优势。本文以Columbia野生型拟南芥为材料，用酶解法对拟南芥叶肉进行原生质体分离，用PEG介导的转化法将外源基因转化到原生质体中进行瞬时表达。文章着重分析了影响拟南芥叶肉原生质体分离和转化的因素，最终确定了原生质体的最优分离条件，建立了以拟南芥叶肉原生质体为基础的瞬时表达体系。主要实验结果如下： 1.拟南芥叶肉原生质体分离的最优酶液组成及浓度。用纤维素酶R-10、半纤维素酶、果胶酶、离析酶R-10、崩溃酶的不同酶类组合对拟南芥叶肉进行原生质体分离，结果发现，在CPW盐溶液中附加1.5％纤维素酶R-10及0.5％离析酶R-10时，分离效率最高，原生质体个数达到9.55×106/gFW，此时细胞碎片数量也最少。 2.最佳酶解条件。分别对酶解时间、酶液PH等因素进行分析。结果发现，酶PH为6.0，28℃黑暗条件酶解4h时，原生质体产量和活力最高(产量：11.42×106个/gFW，活力：90.2％)。 3.原生质体稳定性与活力测定。选择甘露醇做为渗透压调节剂使原生质体细胞保持完整形态，用FDA染色法检测原生质体活力。结果发现，拟南芥叶肉原生质体在0.4M甘露醇的渗透压环境中可以保持完整形态，此时破碎的细胞最少，原生质体活力最高，达到90.1％。 4.瞬时表达体系的建立。选择内质网膜内嵌蛋白SIP及肌动蛋白相关蛋白ARP6进行研究。通过RT-PCR扩增得到SIP(720bp)基因及ARP6(1200bp)基因，再将它们分别构建到瞬时表达载体pA7-YFP上，用PEG法将其转化入拟南芥叶肉原生质体进行表达。分析了PEG浓度，质粒DNA含量，原生质体个数等因素对转化的影响。结果发现，转化效率在一定范围内随PEG浓度及质粒DNA含量的升高而升高，当转化体系中PEG浓度为20％，质粒DNA含量为20μg，原生质体细胞数为2.5×104个时转化效率最高(69.37％)。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分 文献综述

第一章：植物原生质体分离研究进展

1.概述

2.植物原生质体的分离研究进展

3.植物原生质体分离的影响因素

第二章：植物原生质体遗传转化研究进展

1.概述

2.植物遗传转化方法的研究进展

3.展望

4.研究目的与意义

第二部分材料与方法

第三章拟南芥原生质体的分离纯化

1.实验材料

2.实验器材

3.实验方法

第四章 原生质体瞬时表达

1.瞬时表达载体的构建

2.质粒的大量抽提纯化及瞬时表达

第三部分 结果与分析

第五章拟南芥原生质体分离纯化

1.不同酶液组成及浓度对拟南芥叶肉原生质体分离的影响

2.酶解时间对原生质体分离的影响

3.酶液PH对原生质体分离的影响

4.渗透压对原生质体分离的影响

5.拟南芥叶肉原生质体的纯化

6.拟南芥叶肉原生质体活力检测

第六章原生质体瞬时表达

1.瞬时表达载体的构建

2.PEG介导的拟南芥叶肉原生质体转化

3.瞬时表达结果

第四部分 讨论

第七章 拟南芥叶肉原生质体分离纯化的影响因素

1.材料来源

2.预处理

3.酶液及酶解条件

第八章瞬时表达的影响因素

1.PEG浓度对转化的影响

2.质粒浓度与纯度对转化的影响

3.原生质体数目对转化的影响

第九章结论

参考文献

致 谢