条斑紫菜叶状配子体营养细胞和生殖细胞的蛋白质组分析比较

摘要

条斑紫菜是我国重要的经济栽培海藻，围绕其育种育苗以及相关生理生化等方面的研究已经展开并积累了一定的研究基础。
　　性别分化是发育生物学中重要的科学问题之一，恰当的实验材料的选择是促进此研究取得进展的重要因素。条斑紫菜因其叶状配子体由单层细胞组成，雌雄同株，大部分精子囊细胞分布在其边缘，从营养细胞向性细胞的分化过程相当于高等植物减数分裂后子细胞的后续发育过程，所以是研究营养细胞向性细胞分化发育过程这一重要科学问题的理想材料。
　　本实验中，取新鲜紫菜，放在与其生长条件温度相同的大量的水体中以维持其良好的生理活性并立即利用刀片分别收集条斑紫菜的营养细胞和精子囊细胞，切下来的细胞迅速在显微镜下观察，营养细胞是独立的大细胞，每个精子囊细胞分成2-8个不等的部分，两种材料迅速用液氮冷冻之后分别收集约2g，于-80℃冻存。综合比较饱和硫酸铵沉淀法、三氯乙酸/丙酮沉淀法、酚提取法等蛋白质提取方法，发现酚提取方法能够有效地去除蛋白质中的多糖、色素等杂质，因此确定最适合条斑紫菜蛋白提取的方法为酚提取法。并且酚提取方法中使用的试剂不会对后续质谱鉴定实验造成影响，利用改良酚法提取两种材料的可溶性总蛋白之后，双向电泳检测提取的蛋白良好，再利用ITRAQ标记技术对两种材料的蛋白质干粉进行差异蛋白的分析，发现这两种材料中的差异蛋白共有549种，筛选之后共获得具有稳定差异的蛋白质101种，精子囊细胞相对于营养细胞有88种蛋白质的含量表现为下调，13种蛋白质的含量表现为上调。这101种蛋白质中，与蛋白质翻译有关的蛋白质有31种，光合作用有关的蛋白质有29种，ATP合成相关的蛋白质9种，脂肪酸合成的7种。从这101种差异蛋白中我们筛选与蛋白质合成、碳循环、ATP合成相关的蛋白质进行实时荧光定量的实验，结果表明，对于营养细胞，肌动蛋白，HSP90，HSP70-2，细胞色素f，钙调蛋白在精子囊细胞中含量都比较低，微管蛋白和组蛋白H2B含量较高。其中HSP70-2，钙调蛋白与ITRAQ的结果相反，其他的都一致。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 选题背景及意义

1．2 条斑紫菜的生物学特征

1．2．1 条斑紫菜的分类地位及分布

1．2．2 条斑紫菜的生活史

1．3 条斑紫菜的栽培

1．4 蛋白质组学的研究内容和应用现状

1．4．1 蛋白质组学的相关概念以及研究内容

1．4．2 蛋白质组学的研究现状

1．4．3 蛋白质组学的研究方法

1．5 实时荧光定量PCR技术简介

1．5．1 实时荧光定量技术的原理

1．5．2 常用的荧光标记方法

1．5．3 定量策略

2 条斑紫菜不同组织样品双向电泳体系的建立

2．1 材料与方法

2．1．1 材料的采集

2．1．2 实验仪器

2．1．3 实验试剂

2．2 实验方法

2．2．1 条斑紫菜可溶性蛋白的提取

2．2．2 样品蛋白质的溶解

2．2．3 蛋白质定量

2．2．4 双向电泳

2．2．5 凝胶染色

2．2．6 图像扫描与采集

2．3 结果

2．3．1 显微镜下观察到的条斑紫菜不同组织细胞的细胞形态

2．3．2 蛋白质含量测定

2．3．3 条斑紫菜不同组织材料可溶性蛋白电泳图谱

3 利用ITRAQ技术处理条斑紫菜的不同组织样品

3．1 材料与方法

3．1．1 材料的采集

3．1．2 实验仪器

3．1．3 实验试剂

3．1．4 其它用品

3．2 实验方法

3．2．1 条斑紫菜可溶性蛋白的提取

3．2．2 样品蛋白质的溶解

3．2．3 蛋白质定量

3．2．3 蛋白酶解

3．2．4 ITRAQ标记

3．2．5 酶解肽段离线预分离及LC-MS／MS质谱分析

3．2．6 纳升级反相色谱-TripleTOFTM5600进行蛋白质分析

3．2．7 质谱参数设置

3．3 结果

3．3．1 质谱数据分析

3．3．2 鉴定质量评估

3．3．3 蛋白质鉴定

3．3．4 蛋白质定量

3．3．5 蛋白质丰度比分布

3．3．6 数据的生物信息解析

3．4 讨论

3．4．1 相对于条斑紫菜的营养细胞在精子囊细胞中表达上调的蛋白功能

3．4．2 条斑紫菜精子囊细胞发生过程中的代谢调控

4 条斑紫菜叶状配子体营养细胞和精子囊细胞部分差异蛋白的转录水平分析

4．1 材料与方法

4．1．1 条斑紫菜叶状配子体营养细胞和精子囊细胞的获得

4．1．2 实验仪器与试剂

4．2 实验方法

4．2．1 引物设计

4．2．2 总RNA的提取和反转录

4．2．3 琼脂糖凝胶电泳检测

4．2．4 DNA的消化以及反转录

4．2．5 标准品的制备

4．2．6 实时荧光定量PCR

4．2．7 标准曲线的构建

4．2．8 定量分析

4．3 实验结果

4．3．1 RNA的提取

4．3．2 引物的可用性评估

4．3．2 荧光定量PCR的标准曲线

4．3．3 讨论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢