硝基呋喃类兽药胶体金免疫层析检测方法研究

摘要

硝基呋喃类兽药在水产、家畜养殖中违规使用现象普遍，本研究以硝基呋喃类兽药代谢物为研究对象，建立呋喃唑酮代谢物AOZ、呋喃它酮代谢物AMOZ、呋喃妥因代谢物AHD、呋喃西林代谢物SEM胶体金免疫层析试纸条快速检测方法，并应用于动物源性食品中硝基呋喃类兽药代谢物的可视化检测。
　　呋喃唑酮代谢物AOZ胶体金试纸条的最适条件为:NC膜（硝酸纤维素膜）为Millipore HF90s;胶体金粒径20nm;金标抗体最适工作pH为9;金标抗体中抗体使用量为20μg;羊抗鼠二抗稀释倍数10倍;金标抗体稀释倍数8倍;包被原浓度0.4 mg/mL;包被原与抗体均用PB稀释液稀释;划膜时二抗和包被原喷涂量0.3μL/cm; NC膜不需要封闭处理。呋喃唑酮代谢物AOZ胶体金试纸条检测限为0.5μg/kg（以NPAOZ计），检测时间约10min。动物源性食品检测限为0.1μg/kg（以AOZ计）。
　　呋喃它酮代谢物AMOZ胶体金试纸条的最适条件为:NC膜（硝酸纤维素膜）为Millipore HF90s;胶体金粒径20nm;金标抗体最适工作pH为9;金标抗体中抗体使用量为20μg;羊抗鼠二抗稀释倍数10倍;金标抗体稀释倍数5倍;包被原浓度2mg/mL;包被原与抗体均用PB稀释液稀释;划膜时二抗和包被原喷涂量0.3μL/cm; NC膜不需要封闭处理。呋喃它酮代谢物AMOZ胶体金试纸条检测限为2μg/kg（以NPAMOZ计），检测时间约10min。动物源性食品检测限为0.5μg/kg（以AMOZ计）。
　　呋喃西林代谢物SEM胶体金试纸条的最适条件为:NC膜（硝酸纤维素膜）为Millipore HF90s;胶体金粒径20nm;金标抗体最适工作pH为9;金标抗体中抗体使用量为40μg;羊抗鼠二抗稀释倍数10倍;金标抗体稀释倍数6倍;包被原浓度2mg/mL;包被原与抗体均用PB稀释液稀释;划膜时二抗和包被原喷涂量0.3μL/cm; NC膜不需要封闭处理。呋喃西林代谢物SEM胶体金试纸条检测限为3μg/kg（以NPSEM计），检测时间约10min。动物源性食品检测限为0.5μg/kg（以SEM计）。
　　呋喃妥因代谢物AHD胶体金试纸条的最适条件为:NC膜（硝酸纤维素膜）为Millipore HF90s;胶体金粒径20nm;金标抗体最适工作pH为9;金标抗体中抗体使用量为30μg;羊抗鼠二抗稀释倍数10倍:金标抗体稀释倍数5倍;包被原浓度2mg/mL;包被原与抗体均用PB稀释液稀释;划膜时二抗和包被原喷涂量0.3μL/cm; NC膜不需要封闭处理。呋喃妥因代谢物AHD胶体金试纸条检测限为5μg/kg（以NPAHD计），检测时间约10min。动物源性食品检测限为0.8μg/kg（以AHD计）。
　　呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物多残留胶体金试纸条的最适工作条件为:NC膜（硝酸纤维素膜）为Millipore HF90s;胶体金粒径20nm;金标抗体最适工作pH为9;金标抗体中呋喃它酮代谢物抗体和呋喃妥因代谢物抗体使用量分别为20μg和30μg;羊抗鼠二抗稀释倍数10倍;金标抗体稀释倍数5倍;包被原浓度2mg/mL;包被原与抗体均用PB稀释液稀释;划膜时二抗和包被原喷涂量0.3μL/cm; NC膜不需要封闭处理。呋喃它酮代谢物和呋喃妥因代谢物多残留胶体金试纸条检测限分别为2μg/kg和30μg/kg(以NPAMOZ和NPAHD计)，检测时间约10min。动物源性食品检测限分别为0.3μg/kg和4μg/kg（以AMOZ和AHD计）。
　　呋喃唑酮代谢物和呋喃西林代谢物多残留胶体金试纸条的最适工作条件为:NC膜（硝酸纤维素膜）为Millipore HF90s;胶体金粒径20nm;金标抗体最适工作pH为9;呋喃唑酮代谢物抗体和呋喃西林代谢物抗体使用量分别为20μg和40μg;羊抗鼠二抗稀释倍数10倍;金标抗体稀释倍数分别为8倍和6倍;包被原浓度2mg/mL;包被原与抗体均用PB稀释液稀释;划膜时二抗和包被原喷涂量0.3μL/cm; NC膜不需要封闭处理。呋喃唑酮代谢物和呋喃西林代谢物多残留胶体金试纸条检测限分别为5μg/kg和10μg/kg（以NPAOZ和NPSEM计），检测时间约10min。动物源性食品检测限分别为0.5μg/kg和0.8μg/kg（以AOZ和SEM计）。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 研究背景

1．1．1 兽药残留现状

1．1．2 兽药残留造成的危害

1．1．3 兽药残留造成的食品安全事件

1．2 硝基呋喃类药物概述

1．2．1 硝基呋喃类药物简介

1．2．2 硝基呋喃类药物用途

1．2．3 硝基呋喃类药物危害

1．2．4 硝基呋喃类兽药代谢物残留检测方法

1．3 胶体金免疫层析技术

1．3．1 胶体金免疫层析技术的基本原理

1．3．2 胶体金的结构

1．3．3 胶体金的特性

1．3．4 胶体金的制备方法

1．3．5 免疫层析试纸条组装

1．3．6 胶体金免疫层析技术的优势与应用

1．4 本研究的目的及意义

1．5 研究的内容

2 材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要药品与试剂

2．1．2 主要仪器与设备

2．1．3 待测样品

2．1．4 主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 抗体效价及特异性的测定

2．2．2 胶体金溶液的制备

2．2．3 金标抗体的制备

2．2．4 胶体金免疫层析试纸条条件的优化

2．2．5 胶体金免疫层析试纸条的组装

2．2．6 胶体金免疫层析试纸条检出限的确定

2．2．7 胶体金免疫层析试纸条特异性的研究

2．2．8 样品衍生化条件的优化

2．2．9 实际样品检测

3 结果与讨论

3．1 胶体金质量的鉴定

3．1．1 裸眼观察法

3．1．2 紫外分光扫描法

3．1．3 胶体金的稳定性研究

3．2 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条

3．2．1 胶体金标记呋喃唑酮代谢物抗体最适蛋白量的研究

3．2．2 胶体金标记呋喃唑酮代谢物抗体最适pH值的研究

3．2．3 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条最适工作条件研究

3．2．4 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条检出限的确定

3．2．5 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条特异性研究

3．2．6 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条检测样品前处理条件优化

3．2．7 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条检测动物源性食品样品

3．2．8 呋喃唑酮代谢物胶体金免疫层析试纸条稳定性研究

3．3 呋喃它酮代谢物胶体金免疫层析试纸条

3．3．1 胶体金标记呋喃它酮代谢物抗体最适蛋白量的研究

3．3．2 胶体金标记呋喃它酮代谢物抗体最适pH值的研究

3．3．3 胶体金标记呋喃它酮抗体免疫层析试纸条最适条件研究

3．3．4 呋喃它酮代谢物胶体金免疫层析试纸条检出限的确定

3．3．5 呋喃它酮代谢物胶体金免疫层析试纸条特异性研究

3．3．6 呋喃它酮代谢物胶体金免疫层析试纸条检测样品前处理条件优化

3．3．7 呋喃它酮代谢物胶体金免疫层析试纸条检测动物源性食品样品

3．3．8 呋喃它酮代谢物胶体金免疫层析试纸条稳定性研究

3．4 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条

3．4．1 胶体金标记呋喃西林代谢物抗体最适蛋白量的研究

3．4．2 胶体金标记呋喃西林代谢物抗体最适pH值的研究

3．4．3 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条最适条件研究

3．4．4 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条检出限的确定

3．4．5 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条特异性研究

3．4．6 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条检测样品前处理条件优化

3．4．7 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条检测动物源性食品样品

3．4．8 呋喃西林代谢物胶体金免疫层析试纸条稳定性研究

3．5 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条

3．5．1 胶体金标记呋喃妥因代谢物抗体最适蛋白量的研究

3．5．2 胶体金标记呋喃妥因代谢物抗体最适pH值的研究

3．5．3 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条最适条件研究

3．5．4 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条检出限的确定

3．5．5 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条特异性研究

3．5．6 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条检测样品前处理条件优化

3．5．7 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条检测动物源性食品样品

3．5．8 呋喃妥因代谢物胶体金免疫层析试纸条稳定性研究

3．6 呋喃唑酮和呋喃西林代谢物多残留胶体金免疫层析试纸条

3．6．1 多残留胶体金免疫层析试纸条划膜顺序的研究

3．6．2 多残留胶体金免疫层析试纸条检测限的确定

3．6．3 多残留胶体金免疫层析试纸条实际样品的检测

3．6．4 多残留胶体金免疫层析试纸条稳定性研究

3．7 呋喃它酮和呋喃妥因代谢物多残留胶体金免疫层析试纸条

3．7．1 多残留胶体金免疫层析试纸条划膜顺序的研究

3．7．2 多残留胶体金免疫层析试纸条检测限的确定

3．7．3 多残留胶体金免疫层析试纸条实际样品的检测

3．7．4 多残留胶体金免疫层析试纸条稳定性研究

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢