两种淡水龟微卫星标记的筛选及乌龟养殖群体遗传多样性分析

摘要

乌龟(Chinemys reevesii)是我国的广布种,国外分布于日本和朝鲜,具有很高的食用和药用价值,其人工养殖在我国非常广泛。黄喉拟水龟(Mauremysmutica)是我国南方常见龟类之一,国外分布于越南和日本,是培植绿毛龟的优选品种,集美食、保健、药用与观赏于一身,受到消费者青睐,是当前龟类养殖的热门品种之一。由于生态平衡破坏、农药大量使用及人为滥捕等因素的影响,两种淡水龟类的野生资源明显减少,种质资源也面临着严重危机。乌龟在中国红皮书中被列为依赖保护,在IUCN和中国物种红色名录中被列为濒危(EN)等级；黄喉拟水龟在中国红皮书、中国物种红色名录以及IUCN中,都被列为濒危等级。
　　 乌龟和黄喉拟水龟都是我国龟类养殖的热门品种,带动了我国地区经济的发展。另外,对于不存在“家化”问题的淡水龟来说,人工养殖就是一种迁地保护,这在很大程度上保护了野生龟资源。目前为止,人们对这两种龟类的种质资源尚不清楚,也缺乏遗传方面的信息。这与野生龟资源急剧减少、人工养殖迅猛发展的趋势相比,理论方面的研究明显不能满足生产实践的需要,这不仅阻碍了对该物种野生资源的有效保护,而且也极大地制约了其规模化养殖和产业的可持续发展。本实验通过磁珠富集法和FIASCO法对两种淡水龟进行了微卫星标记的开发,并对乌龟养殖群体进行了遗传多样性分析,以期能够为其保护和养殖业的发展提供理论基础。主要研究结果如下:
　　 1.利用磁珠富集法成功筛选出8个具有多态性的乌龟微卫星位点。这8个微卫星位点的等位基因数(NA)从7到17个不等(平均10.88),观测杂合度(Ho)和期望杂合度(HE)的范围分别为0.321-0.966和0.703-0.920。
　　 经过连续的Bonferroni校正,有3个位点显著偏离了哈迪-温伯格平衡(Cre9,Cre37,Cre46),通过MICRO-CHECKER软件分析推测该偏离是由无效等位基因引起。在连锁不平衡检测当中,所有位点都是独立的,
　　 不存在连锁的现象,表明筛选出来的微卫星位点能够单独利用,并能够提供有效的遗传信息。
　　 2.通过FIASCO法成功筛选出14个具有高度多态性的黄喉拟水龟微卫星位点。等位基因数目(NA)从5到15不等。观测杂合度(Ho)和期望杂合度(HE)的范围分别为0.448-0.889和0.593-0.923。经过连续的Bonferroni校正,有7个位点显著偏离了哈迪-温伯格平衡(P<0.001)(Mmu3,Mmu4,Mmu7,Mmu8,Mmu9,Mmu.10和Mmu11)。通过MICRO-CHECKER软件分析得到,这7个位点的无效等位基因频率范围为0.032到0.243。在连锁不平衡检测当中,所有位点都独立分开,不存在连锁现象。
　　 3.利用8个微卫星标记对7个乌龟养殖群体进行了遗传多样性水平的检测。结果显示:7个群体中共检测到等位基因130个,各位点等位基因数目(NA)为9-26个,平均16.25个；多态信息含量为0.57-0.92；观测杂合度(Ho)和期望杂合度(HE)分别为0.30-0.87和0.60-0.93,表明这8个微卫星位点的遗传多样性丰富。分子变异方差分析(AMOVA)表明,5.91％的分化存在于群体间,84.29％的分化存在于个体间。虽然乌龟存在着较高的遗传多样性水平和较低的群体间分化程度,但仍存在着明显的地理变异模式。UPGMA聚类分析得出湖北荆州(HBJZ)自聚为一支；湖南益阳(HNYY),湖南汉寿(HNHS),江苏苏州(JSSZ),上海(SH),浙江海宁(ZJHN),江西弋阳(JXYY)聚为另一支。其中湖北荆州(HBJZ)群体位于长江以北,其余6个群体分布于长江以南,这与他们在地理上分布距离的远近有着显著的相关性。另一方面,7个群体内部都存在着特有等位基因,提示群体间等位基因扩散受到一定程度的限制,同时在育种上,可以作为亲本选育的一个重要参考指标。

目录

文摘

英文文摘

第一章 文献综述

1 龟鳖类简介

1.1 龟鳖类概述

1.2 我国淡水龟的野生资源

2 微卫星标记简介

2.1 微卫星的发现及概念

2.2 微卫星的类型、功能和产生机理

2.3 微卫星的优缺点

2.4 微卫星标记开发策略

2.5 微卫星标记在濒危动物保护和遗传育种中的作用

2.6 微卫星标记在龟鳖类以及其他濒危物种中的应用

3 本论文研究目的和意义

第二章 磁珠富集法筛选乌龟微卫星引物

1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 数据分析

4 结果和讨论

第三章 FIASCO法筛选黄喉拟水龟的微卫星引物

1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 实验方法

3 数据分析

4 结果和讨论

第四章 乌龟养殖群体的遗传多样性分析

1 引言

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

3 数据分析

3.1 哈迪-温伯格平衡的检测和群体遗传多样性分析

3.2 遗传分化和遗传结构

3.3 距离隔离(Isolation by Distance,IBD)模式

4 结果

4.1 群体间的遗传变异

4.2 遗传分化和群体结构

4.3 群体间的距离隔离模式

5 讨论

5.1 乌龟的遗传多样性

5.2 乌龟群体间的遗传分化

5.3 哈迪-温伯格平衡

第五章 小结和展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文