球形红细菌硫酸盐活化酶复合体底物通道机理研究

摘要

硫是生命活动的必需元素之一,哺乳动物可直接吸收利用来自食物的硫,而植物和微生物则主要通过吸收周围环境中的硫酸盐,作为体内硫元素的主要来源。ATP硫酸化酶(ATP sulfurylase,ATPS)催化的硫酸盐与ATP反应生成腺苷-5’-磷酰硫酸(adenosine 5’-phosphosulfate,APS)和焦磷酸的反应是硫酸盐进入细胞内活化反应的第一步,此反应非常不易进行。研究发现,胞内ATPS通常与其他硫代谢相关酶组成硫酸盐活化酶复合体(sulfate activating complex,SAC)促进APS合成及硫的同化。
　　 球形红细菌SAC是双功能酶,具有ATPS和APSK活性,且对APS具有底物通道效应,是至今发现的唯一具有底物通道效应的SAC。为了探讨APS通道的机理,我们主要进行了三部分的研究工作:SAC的寡聚化分析;电荷在APS运动中的作用分析；APS的磷酸化。
　　 根据SAC的晶体结构,利用蛋白定点突变技术获得突变蛋白A219、K564及G424,以期得到不同程度寡聚化SAC,为进一步探讨APS通道结构奠定基础。目前结果表明,我们纯化的双功能SAC突变体寡聚化程度没有受到突变影响。
　　 为研究电荷在APS通道中的功能,我们将推测的通道中带电荷氨基酸分别突变为不带电荷氨基酸或带相反电荷氨基酸,并纯化、分析了突变蛋白的ATPS和APSK活性。结果发现ATPS活性中心的MTKPGD环(229-234,简称KD环)对ATPS的活性具有重要作用,K231E突变后使ATPS的活性降低至野生型蛋白的1％,而D234突变后ATPS的活性完全丧失。E109及K438突变引起APSK催化活性的降低,其催化效率均降低90％左右。另外的突变对ATPS和APSK活性影响较小。
　　 前期研究发现球形红细菌SAC在无ATP存在的情况下可磷酸化APS形成PAPS。通过对其晶体结构分析,我们推测此SAC形成酶磷酸复合体(E·P)的可能磷酸化位点S405、S407或者S410。通过对这几个位点进行突变,利用抗磷酸化丝氨酸的抗体做Western杂交,可验证形成E·P时的磷酸化丝氨酸。结果表明此三个位点突变均没有影响Western结果,且S405和S407突变没有影响APSK的活性；而S410A突变却使APSK失活,暗示S410对于APSK催化功能具有重要的作用。
　　 以上工作的完成为我们进一步分析APS通道的机理奠定了坚实的基础。