基于异喹啉类生物碱小分子与AP-DNA相互作用的DNA识别

摘要

细胞的功能主要依靠基因组的精确度，这种精确度受到DNA各种缺失的威胁。由体内糖苷酶剪切DNA分子中损伤碱基的过程中产生的脱嘌呤或脱嘧啶位点，统称为脱碱基位点(AP位点)，它是一种常见的DNA变异和致癌的损伤DNA缺失。这种由碱基缺失所引起DNA序列多态性与人类各种各样的疾病密切相关，近几年来，利用小分子检测核苷碱基以及AP位点的DNA检测受到广泛关注，这种方法不仅有助于从分子水平上理解药物的抗癌机制而且为功能性传感器的设计提供了新的思路。然而，虽然人们对小分子识别AP位点或核苷碱基已经做了大量的研究，但大多基于的是荧光猝灭机制，其高背景信号对DNA的检测带来诸多限制。基于此，本文建立了基于小分子与AP位点相互作用的荧光增强型、荧光背景低的DNA识别方法。本论文选用具有代表性的异喹啉生物碱小分子—小檗碱和血根碱作为荧光探针，通过小檗碱与AP-DNA(含AP位点的DNA)的强烈的特异性结合实现了的荧光增强型伴随荧光双峰的多色性的核苷碱基的识别;基于与血根碱与AP-DNA的相互作用实现了较大发射位移的AP位点的识别;最后发现小檗碱还可以应用于检测四连体DNA。主要研究内容如下:
　　1.采用小檗碱分子为荧光探针，借助DNA中AP位点的设计，建立了DNA核苷碱基的识别方法。在一定的条件下，小檗碱强烈特异性与AP-DNA结合，本文利用紫外可见吸收光谱，荧光稳态和荧光寿命，DNA熔点测定，荧光共振能量转移等表征方法对小檗碱强与AP-DNA结合的特异性进行了研究。实验结果表明:弱荧光性的小檗碱易与AP位点强烈结合，荧光显著增强.且其荧光性质随脱碱基位点对面碱基及侧翼碱基的不同而不同,当侧靶标碱基为嘧啶时，小檗碱的荧光出现双峰;而当靶标碱基为嘌呤时，只出现单峰。本文就双峰出现的机理也进行了一定的探讨。这一工作实现了荧光增强型的具有发射双峰DNA碱基的识别。与之前的检测方法相比，此方法的优越性在于实现了荧光增强型的多色的碱基识别，为核苷酸碱基的识别提供了一种更简便、快速、有效的方法。
　　2.选用血根碱为荧光探针，在DNA中设置AP位点，基于血根碱与AP位点的特异性结合，建立了荧光选择性增强同时发射位置出现较大变化的识别AP位点的荧光方法。在水溶液中，血根碱溶液中存在着季铵盐形式（离子型）和非离子形式（不带电荷）两种结构的平衡，这种平衡与pH有关，在一定条件下，两种结构可以相互转化。实验发现:在PH为8.3的条件下，当有AP位点存在时，非离子型的血根碱转化成离子型结构，发射出现多达170nm的移动，且血根碱的离子型荧光会随着AP位点对面碱基不同有不同程度增强。而当靶标DNA不含AP位点即FM-DNAs，发射峰移动不明显，荧光发生猝灭。本章通过紫外可见吸收光谱、稳态荧光、荧光寿命、DNA熔点测定等表征分析方法研究了血根碱与AP-DNAs，FM-DNAs相互作用的荧光特性，同时对其机理进行了探讨。本实验基于血根碱与AP位点的特异性结合，导致其非离子型转化为离子型结构，从而实现了伴随着较大的发射位移实现AP位点的检测。
　　3.恶性肿瘤严重的危害着人类健康和生命，近几十年来，抗肿瘤新药的研发已取得了显著成就，其中以G-四链体为靶点的抗肿瘤药物的研究引起了人们的密切关注。研究表明，诱导DNA形成G-四链体或者能与G-四链体结合并使之稳定的化合物可抑制端粒酶活性或通过降低癌基因的转录表达而具有抗肿瘤的作用，G-四链体逐渐成为一个极具潜力的抗肿瘤药物设计靶点.G-四链体DNA中脱G碱基的存在，明显影响着G-四链体DNA的结构和稳定性，而关于这方面的研究较少。本文考察了异喹啉类生物碱与不同G-四链体DNA相互作用，我们发现小檗碱分子能与chairG3 G-四链体DNA强烈的特异性结合，引起其荧光增强度明显的增强，且实验还发现在K+溶液中荧光增强比在Na+溶液中荧光增强更为显著。小檗碱不仅有望成为一种毒性较低的G-四链体稳定化合物。由于实验时间、实验条件及个人因素等各方面原因，本实验的工作还不完善，考察脱碱基位点对我们所研究体系的影响是以及尝试其他的表征手段以及对小檗碱分子与G-四链体DNA结合的机理问题等也有待进一步研究。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 单核苷酸多态性的检测

1．3 基于小分子与AP-DNA相互作用的DNA识别

1．3．1 基于AP位点的SNP识别原理

1．3．2 小分子与DNA的作用模式

1．3．3 小分子识别DNA研究进展

1．3．4 小分子与DNA作用的研究方法

1．4 异喹啉类生物碱的性质及其与DNA作用研究进展

1．4．1 异喹啉类生物碱的结构

1．4．2 异喹啉类生物碱的理化性质

1．4．3 异喹啉类生物碱的药理性质

1．4．4 异喹啉类生物碱与DNA相互作用的研究进展

1．5 本课题选题依据及主要研究内容

1．6 研究意义和主要的创新点

第二章 实验部分

2．1 实验所用试剂和仪器设备

2．1．1 实验所用试剂及所用DNA序列

2．1．2 实验主要仪器及型号

2．2 主要的研究方法

第三章 基于小檗碱与AP位点特异性结合的荧光增强型、多色性的碱基识别

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 样品的配制

3．3 结果和讨论

3．3．1 实验方案

3．3．2 小檗碱选择特异性与AP位点结合

3．3．3 侧翼碱基对小檗碱识别碱基作用的修饰

3．3．4 小檗碱识别作用的高选择性

3．3．5 小檗碱与AP-DNA作用方式的探讨

3．3．6 荧光双峰机理的阐述

3．4 本章小结

第四章 基于血根碱与AP位点特异性结合，伴随大的发射位移的AP位点识别

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 样品的配制

4．3 结果和讨论

4．3．1 实验方案

4．3．1 血根碱的荧光光谱性质

4．3．2 “70nm的发射位移、荧光特异性增强”识别AP位点

4．3．3 血根碱与AP-DNA作用方式的讨论

4．4 本章小结

第五章 小檗碱与G-四链体DNA特异性结合

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 样品的配制

5．3 结果和讨论

5．3．1 不同生物碱与15个相同碱基的荧光实验

5．3．2 小檗碱与不同G-四链体在Na+和K+存在下的荧光实验

5．3．3 脱碱基位点对G-四链体DNA的结构和稳定性的影响

5．4 本章小结

结论与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间取得的研究成果

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