三角帆蚌转录组测序及珍珠颜色相关差异表达基因分析

摘要

三角帆蚌（Hyriopsis cumingii）是中国重要的淡水育珠蚌，其生产的珍珠占世界总淡水珍珠的98％以上。珍珠是一种天然的有机宝石，既可作为药物和饰品使用，又可应用于化妆品领域，珍珠的生物学特性使得其在仿生学材料方面的研究逐渐引起研究者的兴趣。颜色对于珍珠来说是影响价值和的质量的重要指标。研究三角帆蚌珍珠颜色的分子调控机制，将有助于实现培育特定颜色珍珠。三角帆蚌珍珠颜色分子机制的分子生物学研究较少，因此，大量挖掘三角帆蚌珍珠颜色相关基因具有重要的理论和实践意义。
　　为筛选影响三角帆蚌珍珠颜色的候选基因，本研究采用转录组测序平台Illumina HiSeqTM2500对蚌壳珍珠层颜色为紫色和白色的三角帆蚌的中央膜组织进行高通量测序，获得了大量的Unigene序列，筛选出大量SSR分子标记，为三角帆蚌亲缘关系分析、群体遗传学、分子标记辅助育种等相关研究提供参考。主要研究结果如下:
　　1.三角帆蚌转录组测序及分析
　　利用Illumina高通量测序技术对蚌壳珍珠层颜色为白色和紫色的三角帆蚌的中央膜组织进行转录组测序，所得序列经质量控制、拼接组装后注释至NR、Swiss-Prot、COG、KOG、KEGG、GO和Pfam这几个数据库中，并进行差异基因聚类分析。结果得到了89，529个Unigene，差异表达基因2，644个，其中上调表达基因1，323个，下调表达基因1，321个。转录组数据经筛查共得到7，539个微卫星标记和1，759，869个单核苷酸多态性标记。根据GO功能分类可以分为50分支，根据KEGG代谢通路分析可以分为187类。对差异表达基因分析发现，部分基因与色素（眼黄素、黑色素、喋啶色素）合成与转运相关，还有6个细胞色素P450，3个细胞色素b561和1个细胞色素b560。推测这些基因可能在珍珠颜色形成过程中发挥作用。
　　2.三角帆蚌SSR分布特征及引物的开发利用
　　基于三角帆蚌转录组文库高通量测序产生的89，529个Unigene序列，检索到7，539个SSR位点。对这些SSR位点设计引物并随机挑选150对引物进行PCR扩增，得到102个微卫星位点具有清晰的扩增条带，进一步验证发现40对引物具有多态性，用30个三角帆蚌群体检测这40对引物的多态性，发现等位基因数在2～15之间，平均等位基因数为6.63，观测杂合度在0.0333～0.9667，期望杂合度在0.3254～0.8977之间，平均值分别为0.5107和0.7054。平均多态信息含量为0.6468，有13个位点经过Bonferroni校正的Hardy-Weinberg平衡检验仍偏离平衡。
　　3.珍珠颜色相关基因表达分析
　　从转录组文库中筛选出5个颜色相关基因:酪氨酸酶基因HcTyr1、虾红素金属蛋白酶基因HcAst、细胞色素P450基因HcCyt、色氨酸双加氧酶基因HcTDO和1个卟啉相关基因尿卟啉原脱羧酶基因HcUROD。三角帆蚌中央膜主要参与珍珠层形成，前后端缘膜主要参与珍珠层和棱柱层形成。HcTyr1编码的酪氨酸酶参与合成素黑色素，荧光定量结果显示:HcTyr1基因主要在前后端缘膜上表达，中央膜上表达量低，在其他组织中几乎不表达;在紫色蚌的后端缘膜上的表达量显著高于白色蚌(P＜0.05)，推测HcTyr1基因可能参与三角帆蚌贝壳珍珠层与棱柱层颜色形成，且与紫色珍珠层颜色形成具有极大相关性。HcAst基因编码的虾红素金属蛋白酶是一种锌依赖的金属酶，HcAst基因在三角帆蚌各组织中均有表达，在紫色蚌前后端缘膜的表达量极显著高于白色蚌(P＜0.01)，中央膜的表达量显著高于白色蚌（P＜0.05），推测HcAst基因参与三角帆蚌紫色贝壳珍珠层颜色形成。HcCyt基因编码的细胞色素P450是一种细胞色素，HcCyt基因在三角帆蚌各组织中均有表达，且表达量最高的组织是肝胰腺组织，推测HcCyt基因可能参与肝胰腺组织中外源物质代谢;紫色蚌中HcCyt基因在中央膜组织中的表达极显著高于前后端缘膜和白色蚌的中央膜(P＜0.01)，推测HcCyt基因可能参与了三角帆蚌珍珠层紫色颜色形成。HcTDO基因编码的色氨酸加氧酶参与合成眼黄素，HcTDO基因主要在三角帆蚌前后端缘膜表达，在紫色蚌的后端缘膜中的相对表达量极显著高于白色蚌(P＜0.01)，说明HcTDO基因与三角帆蚌紫色珍珠层形成具有较大相关性。HcUROD基因编码的尿卟啉原脱羧酶参与合成血红素，在三角帆蚌各组织中均检测到HcUROD基因的表达，HcUROD基因在两种颜色蚌的外套膜中表达规律一致，都是后端缘膜中的表达量极显著高于中央膜(P＜0.01)，且紫色蚌外套膜表达量高于白色蚌，说明HcUROD基因参与棱柱层和珍珠层颜色形成，且与紫色珍珠层颜色有较大相关性。

目录

摘要

第一章 文献综述

1 珍珠颜色致色因素研究进展

1．1 金属离子致色

1．2 有机物致色

1．3 结构致色

2 高通量测序在软体贝类中的应用

3 珍珠颜色相关基因研究

4 本研究的目的方法及意义

第二章 三角帆蚌转录组测序分析

1 引言

2 实验材料

2．1 实验动物的采集

2．2 实验仪器

2．3 试剂

3 实验方法

3．1 RNA提取及检测

3．2 文库构建与高通量测序

3．3 转录组的测序数据处理及生物信息学分析

4 结果与分析

4．1 RNA提取与检测

4．2 测序数据质量情况

4．3 转录组测序数据组装结果

4．2 转录组测序文库质量评估

4．4 Unigene功能注释

4．5 三角帆蚌转录组差异表达基因

4．6 单核苷酸多态性和微卫星的筛查

5 讨论

5．1 三角帆蚌转录组测序分析

5．2 转录组文库注释分析

5．3 不同内壳色三角帆蚌中央膜差异表达基因的分析

第三章 利用三角帆蚌转录组文库开发微卫星标记

1 引言

2 材料和方法

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验试剂

2．4 实验方法

3 结果

3．1 转录组中SSR标记分析

3．2 三角帆蚌SSR引物筛选结果

3．3 三角帆蚌养殖群体遗传多样性分析

4 讨论

第四章 珍珠颜色相关差异表达基因分析

2．1 实验材料

2．2 实验仪器

2．3 实验试剂及耗材

2．4 实验方法

3 结果与分析

3．1 RNA提取结果

3．2 引物序列

3．3 荧光定量结果

4 讨论

结论与展望

参考文献

攻读学位期间取得的研究成果

致谢

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